材料和试剂

针（BD，目录号：305167）或磁带
尼龙绳（Dynarex，目录号：3243）
22 G x 1"Exel Safelet导管（Exel International，目录号：26746）
1 ml注射器（BD，目录号：309659）
1.5ml Eppendorf管（VWR，目录号：87003-294）
0.22μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGP033RS）
小鼠（杰克逊实验室）
70％乙醇（Decon Labs，目录号：2701）
蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：36978）}
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
七水合磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4·7H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：BP331-500）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Acros Organics，目录号：205925000）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：A9434-1KG）
碳酸氢钾（KHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：P9144-1KG）
注意：本产品已停产。
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（Na 2 O 2 -EDTA-2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134-100G）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
ACK裂解缓冲液（参见食谱）

设备

CO ₂室
生物安全柜
泡沫塑料板
镊子（Roboz手术器械，目录号：RS-5135）
剪刀（Roboz手术器械，目录号：RS-6802）
离心机（Eppendorf，型号：5417 R）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：3110）
显微镜（Olympus，型号：CK30）

程序

在CO 2室中通过CO 2吸入牺牲小鼠。
将鼠标移到生物安全柜。
用70％乙醇减压老鼠。
将鼠标放在聚苯乙烯泡沫面板上，用手指或胶带固定手臂和腿部（图1A）。
使用剪刀从腹部到颈部切开皮肤，用镊子撕开皮肤以暴露胸廓和颈部（图1A）。
轻轻取出颈部肌肉以暴露气管（图1B）
使用镊子将〜10厘米长的尼龙线放在气管下（图1C）。
仔细切开肋骨以暴露心脏和肺部（图1D）。
注意：不要切断气管和肺。
将22 G x 1"Exel Safelet导管插入气管，取出探针枢纽，并用尼龙线将导管和气管连接牢固（图1E-1G）。
加入1 ml注射器，加入0.8 ml PBS，将其置于导管末端（图1H）

图1.小鼠支气管肺泡灌洗步骤
缓慢注射和吸取PBS 4次，从导管中取出注射器，并将回收的灌洗液在冰上保存在1.5ml Eppendorf（EP）管中。
重复步骤10-11再三次。
根据1.5 ml EP管上的刻度记录BAL体积。
在4℃下以800 x g离心10分钟。
将上清液转移到新的5ml管中，加入蛋白酶抑制剂混合物至终浓度为1mM和PMSF至终浓度为1mM，并充分混合。储存于-80°C，如果不立即使用。 BAL液（BALF）上清液中的细胞因子/趋化因子和其他成分的蛋白质可以通过二辛可宁酸蛋白测定法，ELISA，luminex测定法和/或其他测定法进行分析。
将BAL细胞沉淀重悬于200μlPBS中，并结合细胞悬液
在4℃下以800 x g离心10分钟。
将BAL细胞沉淀重悬于100-200μlACK裂解缓冲液中，在冰上裂解红细胞10分钟，然后加入1ml PBS以停止裂解。
在4℃下以800 x g离心10分钟。
将BAL细胞沉淀重悬于400μlPBS中，通过将约20μl的细胞样品摄入血细胞计数器并在显微镜下计数细胞来计数细胞。记录单元格编号。然后将这些BAL细胞用于FACS分析，旋转到载玻片上进行染色（图2），和/或裂解用于RNA或蛋白质提取。

图2.鼠BAL中免疫细胞的Hema3染色。白色箭头：巨噬细胞;灰色箭头：淋巴细胞;黑色箭头：嗜中性粒细胞。比例尺= 10μm

数据分析

取出小鼠BAL细胞，并将细胞移植到载玻片上，Hema3染色以确定免疫细胞。

笔记

虽然来自所有四个洗涤液的沉淀的BAL细胞被组合以分析细胞，但是可以将来自前两次洗涤的上清液（方法步骤11）组合以分析BAL液体组分，因为前两次洗涤含有这些组分的高浓度。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1升）
8.0克NaCl
0.2克KCl
1.15g Na 2 HPO 4< 7H 2< 2><< / 0.2g KH 2 PO 4
调整至pH 7.4
ACK裂解缓冲液（1L）
1升去离子水
8.29g NH 4 Cl
1克KHCO 3
37.2mg Na 2 -EDTA
将pH调节至7.2-7.4，使用0.22μm过滤器灭菌，在4℃下储存

致谢

作者感谢小曲实验室的成员进行了有益的讨论。这项研究部分由国立卫生研究院（NIH）/国家癌症研究所（NCI）授权R01 CA172090，R21 CA175252，P50 CA090440，P30 CA047904以及美国肺协会（ALA）肺癌发现奖LCD 259111和美国癌症协会（ACS）奖学金奖PF-12081-01-TBG。

参考

Daubeuf，F。和Frossard，N.（2012）。在小鼠中进行支气管肺泡灌洗。 Curr Protoc Mouse Biol 2（2）：167-175。
Qu，Z.，Sun，F.，Zhou，J.，Li，L.，Shapiro，SD and Xiao，G.（2015）。白细胞介素-6阻止起始，但可以增强肺癌的发展。癌症研究 75（16 ）：3209-3215。
Sun，F.，Qu，Z.，Xiao，Y.，Zhou，J.，Burns，TF，Stabile，LP，Siegfried，JM和Xiao，G。（2016）。 NF-κB1p105通过Tpl2激酶抑制肺部肿瘤发生，但与NF-κB功能无关。 a>癌基因 35（18）：2299-2310。
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