材料和试剂

针（BD，目录号：305167）或磁带
10ml注射器（BD，目录号：309604）
27号针（BD，目录号：305109）
尼龙绳（Dynarex，目录号：3243）
22 G x 1"Exel Safelet导管（Exel International，目录号：26746）
1 ml注射器（BD，目录号：309659）
15毫升管（VWR，目录号：89039-666）
60毫米非涂层细胞培养皿（Greiner Bio One International，目录号：628160）
细胞过滤器（70μm）（Fisher Scientific，目录号：22-363-548）
细胞过滤器（40μm）（Fisher Scientific，目录号：22-363-547）
尼龙网（25μm）（ELKO过滤，目录号：03-25/19）
MS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
纤连蛋白涂层板（Corning，目录号：354402）
小鼠（杰克逊实验室）
70％乙醇（Decon Labs，目录号：2701）
分散液（1mg/ml溶于PBS中）（Roche Diagnostics，目录号：4942078001）
1％低熔点琼脂糖（溶于PBS，高压灭菌，等分并储存于4℃）（Lonza，目录号：50100）
DMEM（Lonza，目录号：12-604F）
DNase I（Roche Diagnostics，目录号：10104159001）
生物素化抗CD45（Miltenyi Biotec，目录号：130-101-952）
生物素化抗CD16/CD32（Miltenyi Biotec，目录号：130-101-895）
链霉亲和素微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-048-101）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10437028）}
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
七水合磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4·7H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：BP331-500）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Acros Organics，目录号：205925000）
牛血清白蛋白（BSA）（MP Biomedicals，目录号：199898）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E26282-500G）
注意：本产品已停产。
青霉素 - 链霉素（Lonza，目录号：17-602E）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
标签缓冲液（见配方）

设备

CO ₂室
生物安全柜
泡沫塑料板
镊子（Roboz手术器械，目录号：RS-5135）
剪刀（Roboz手术器械，目录号：RS-6802）
水浴培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Barnstead ^TM 18000A-1CE）
振荡器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Barnstead ^TM 2314）
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：IEC CL40R，目录号：11210927）}
MACS MultiStand（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：3110）

程序

粗制单肺细胞悬液的制备
1. 在CO 2室中通过CO 2吸入牺牲小鼠。
2. 将鼠标移到生物安全柜。
3. 用70％乙醇减压老鼠。
4. 将鼠标放在解剖泡沫聚苯乙烯板上，用针或胶带固定手臂和腿。
5. 使用剪刀从腹部到颈部切开皮肤，用镊子撕开皮肤，露出胸笼和颈部。
6. 轻轻取出颈部肌肉露出气管。
7. 仔细切割肋骨以暴露心脏和肺部。
8. 使用装有27号针头的10ml注射器通过心脏右心室灌注0.9％NaCl的肺，直到目视无血。
9. 使用镊子将〜10厘米长的尼龙绳放在气管下。
10. 将22 G x 1"Exel Safelet导管插入气管，取出指针针座，并用尼龙线扎结，将导管和气管牢固地固定在一起。
11. 慢慢地将2ml的分散液注入肺部，并允许肺塌陷5分钟
12. 快速加载1 ml注射器，加入0.5 ml 1％低熔点琼脂糖（从4°C储存，从70°C水浴中解冻，然后保存在45°C水浴中，熔化状态），更换使用含有琼脂糖的注射器的分散注射器，并用加载的琼脂糖轻轻注入肺。将注射器放在适当位置，立即用冰盖上肺，孵育2分钟以促进琼脂糖凝固。
13. 将肺从动物中取出至含有2ml分散素的15ml管中，在振荡器上室温孵育45分钟。
  注意：抖动有助于消化和释放细胞，但确切的抖动速度并不重要。
14. 将肺转移到含有0.01％DNase I的7ml室温DMEM的60mm未包被的细胞培养皿中。消化的组织用剪刀和镊子从支气管小心地挑逗。
15. 所得到的细胞悬浮液依次通过70μm和40μm细胞过滤器，然后25μm尼龙网过滤
磁性标签
1. 通过血细胞计数器计数经过滤的细胞，在4℃以300×g离心细胞悬浮液10分钟，然后每10个细胞重悬于400μl标记缓冲液中。
2. 加入5μl生物素化抗CD45和生物素化抗CD16/CD32，充分混匀，4℃孵育10分钟。
3. 用1ml标记缓冲液洗涤细胞并在4℃下以300×g离心10分钟。
4. 将细胞沉淀重悬于90μl每10个细胞的标记缓冲液中。
  注意：在步骤B4-B8中，如果使用少于10个单元格，请使用与指示相同的音量。
5. 每10个细胞添加10μl的Streptavidin MicroBeads。
6. 混匀，4℃孵育15分钟
7. 用1ml标记缓冲液洗涤细胞并在4℃下以300×g离心10分钟。
8. 将细胞沉淀重悬于500μl标记缓冲液中。
磁选
1. 将MS色谱柱置于合适的MACS MultiStand的磁场中。
2. 通过用0.5ml标记缓冲液冲洗来制备柱。
3. 将细胞悬液涂于柱上。收集含有未标记细胞的流通，代表肺泡II型细胞。
4. 每次用0.5ml标记缓冲液洗涤柱3次。收集通过的未标记细胞，并与步骤C3的流出物结合。
肺泡II型细胞培养
1. 将合并的废水在4℃下以300×g离心10分钟。将细胞沉淀物重悬于具有10％FBS的DMEM中的10μg/ml细胞/ml，并在未包被的细胞培养板中在加湿的5％CO 2中培养12小时， sub>培养箱中37℃除去附着在板上的残留间充质细胞注意：一般来说，每只小鼠肺将收集4-5百万个细胞，并且将使用〜4ml培养基在10℃下重悬悬浮分离的细胞 细胞/ml。
2. 温和地收集具有未附着细胞（主要是肺泡II型上皮细胞）的细胞悬浮液，并在4℃下以300×g离心10分钟。将沉淀重悬于具有10％FBS的DMEM中并在纤连蛋白包被的平板上培养。肺泡II型上皮细胞的典型形态如图1所示。同时，进行培养的肺泡II型上皮细胞的基因组测序以检测K-Ras基因的突变（图2）。 br />
  
  图1.在纤维连接蛋白包被的平板上在完全DMEM中培养的隔离的鼠肺泡II型上皮细胞5天。右侧的图像是左侧红盒区域的放大倍数。比例尺= 20μm
  
  图2.在肺泡II型上皮细胞中 K-Ras 基因的密码子61突变。Q61密码子： CAA（反向互补：TTG）。

数据分析

孤立肺泡II型上皮细胞的形态学
从氨基甲酸酯治疗的小鼠的分离的肺泡II型上皮细胞中提取基因组DNA。然后将K-Ra 基因的外显子3进行PCR扩增，随后进行测序以检测61位突变。

笔记

注射琼脂糖有助于将Dispase溶液深入肺泡。凝固的琼脂糖可以预防分泌酶溶液的回流，也可以减少支气管细胞如克拉拉细胞的污染。
如果将孤立的肺泡II型上皮细胞用于培养，则在无菌条件下用高压消毒的解剖工具进行所有步骤。
使用该方案，可以检索每只小鼠约4-5×10 6个肺泡II型上皮细胞。分离的细胞可以培养和维持至少8天。最好使用新鲜分离/培养的肺泡II型上皮细胞。不建议冻结细胞进行储存。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1升）
8.0克NaCl
0.2克KCl
1.15g Na 2 HPO 4< 7H 2< 2><< / 0.2g KH 2 PO 4
调整至pH 7.4
标签缓冲区
PBS，pH 7.2
0.5％BSA
2 mM EDTA

致谢

作者感谢小曲实验室的成员进行了有益的讨论。这项研究部分由国立卫生研究院（NIH）/国家癌症研究所（NCI）授权R01 CA172090，R21 CA175252，P50 CA090440，P30 CA047904以及美国肺协会（ALA）肺癌发现奖LCD 259111和美国癌症协会（ACS）奖学金奖PF-12081-01-TBG。

参考

Corti，M.，Brody，AR和Harrison，JH（1996）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8600933"target = "_blank">鼠肺泡II型细胞的分离和原代培养。 Am J Respir Cell Mol Biol 14（4）：309-315。
Qu Z.，Sun F.，Zhou J.，Li L.，Shapiro SD，Xiao G.（2015）。白细胞介素-6阻止起始，但增强肺癌的进展。癌症研究<75>（16）：3209-15。
Rice，WR，Conkright，JJ，Na，CL，Ikegami，M.，Shannon，JM和Weaver，TE（2002）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/12114186"target ="_ blank">体外维护小鼠II型细胞表型。 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol em> 283（2）：L256-264。
Sun，F.，Qu，Z.，Xiao，Y.，Zhou，J.，Burns，TF，Stabile，LP，Siegfried，JM和Xiao，G。（2016）。 NF-κB1p105通过Tpl2激酶抑制肺部肿瘤发生，但与NF-κB功能无关。 a>癌基因 35（18）：2299-2310。
Zhou J.，Qu Z.，Sun F.，Han L.，Li L.，Yan S.，Stabile LP，Chen LF，Siegfried JM，Xiao G ..（2017）。< a class ="ke- insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28108629"target ="_ blank">髓系STAT3通过将肿瘤免疫监视转化为肿瘤促进炎症来促进肺部肿瘤发生。 > Cancer Immunol R 5（3）：257-268。
Zhou，J.，Qu，Z.，Yan，S.，Sun，F.，Whitsett，JA，Shapiro，SD和Xiao，G。（2015）。 STAT3在肺癌的起始和生长中的差异作用。癌基因 34 （29）：3804-3814。