材料和试剂

6个培养皿（TPP，目录号：92406）
注射器1 ml（BD，目录号：300013）
21号针（B.Braun Melsungen，Sterican ^®，目录号：4657527）
1.5ml Eppendorf管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C-S）
200μl移液器吸头（STARLAB INTERNATIONAL，TipOne，目录号：S1111-1000）
1,000μl移液器吸头（STARLAB INTERNATIONAL，TipOne，目录号：S1111-6001）
细胞刮刀（Corning，Falcon ^®，目录号：352340）
硝酸纤维素印迹膜（Amersham）（GE Healthcare，目录号：10600003）
来自瑞士巴塞尔大学Biozentrum的Petr Broz教授获得的永生性小鼠骨髓衍生巨噬细胞（iBMDM）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：31985070）}
尼日利亚钠盐以5mg/ml在100％乙醇中重悬（Sigma-Aldrich，目录号：N7143）
聚（dA：dT）以1mg/ml重悬（InvivoGen，目录号：tlrl-patn-1）
Lipofectamine 2000（Thermo Fischer Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11668019）}
EDTA（Acros Organics，目录号：118432500）
辛磺酸二琥珀酰亚胺酯（DSS）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：21655）}
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：41640）
兔抗ASC抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-22514-R或Martin Oeggerli，Adipogen，目录号：AG-25B-0006-C100）
过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG（H + L）（Jackson ImmunoResearch，目录号：115-035-146）
Nelfinavir Mesylate 10 mM in DMSO（Axon Medchem，目录号：AG-1342）
ECL Western印迹检测试剂（GE Healthcare，目录号：RPN2106）
氯化钠（NaCl）
氯化钾（KCl）（AppliChem，目录号：A1362）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（AppliChem，目录号：131965.1210）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（AppliChem，目录号：A1042）
RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：681870010）}
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10270106）}
青霉素和链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15640055）}
HEPES-KOH（BioConcept，Amimed，目录号：5-31F00-H）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：03777）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
CHAPS（AppliChem，目录号：A1099）
SDS 20％（AppliChem，目录号：A3942）
甘油（AppliChem，目录号：A0970）
溴苯酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
丙烯酰胺（Applichem，目录号：A1672）
TEMED（AppliChem，目录号：A1148）
过硫酸铵（APS）（GE Healthcare，目录号：17-1311-01）
Tris碱（Biosolve，目录号：20092391）
乙醇（Fisher Scientific，目录号：10437341）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：84422）
注意：本产品已停产。
吐温-20（申请，目录号：A1389）
不含脂肪的干乳5％（Migros，Rapilait）
脂多糖（LPS）以5mg/ml重新悬浮于无内毒素游离水中（InvivoGen，目录号：tlrl-eklps）
1x PBS（见食谱）
成长媒介（见食谱）
缓冲液A（参见食谱）
CHAPS缓冲区（见配方）
4x蛋白加载缓冲液（参见食谱）
15％SDS-PAGE（参见食谱）
堆叠凝胶（参见食谱）
迁移缓冲液SDS-PAGE（见配方）
转移缓冲区（见配方）
PBS-Tween（PBS-T）（参见食谱）
阻塞缓冲区（见配方）

设备

移液器（Gilson，Pipetman Classic）
移液器辅助（INTEGRA Biosciences，型号：PIPETBOY acu 2）
37℃，5％CO 2细胞培养箱（Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific TM，型号：8000系列直接热CO 2系列孵化器）
用于1.5ml管的台式冷冻离心机（LabNet International，型号：Prism ^TM）
组织培养二级层流罩（Gelaire，型号：TC48）
SDS-PAGE迁移系统（VWR，Peqlab，型号：PerfectBlue ^{TM双重凝胶系统双ExWS）}
电转印机系统（VWR，Peqlab，型号：PerfectBlue ^TM Tank Electro Blotter）

程序

样品制备和交联
1. 在刺激前18小时，种子巨噬细胞在每个孔中含有2ml生长培养基的6孔板中，每孔条件（简单）为1孔，密度为每孔1.5×10 6个细胞。
2. 用PBS洗涤细胞两次，并在1ml Opti-MEM中用1μg/ml LPS补充细胞2小时
3. 用PBS洗涤细胞两次，通过用5μM尼日利昔酮刺激细胞30分钟或25μM奈非那韦6小时或用2μg/ml聚（dA：dT）转染4小时，使用Lipofectamine 2000（使用DNA/Lipofectamine 2000，比例为1μg/2μl）在1 ml Opti-MEM中
4. 任选的：收获上清以评估成熟IL-1β和半胱天冬酶-1裂解通过蛋白质印迹的释放注意：来自上清液的蛋白质可以使用甲醇/氯仿沉淀。如果需要上清液可以冷冻储存，蛋白质沉淀。重悬于2x蛋白加载缓冲液中的沉淀蛋白也可以冷冻保存以进行进一步的Western印迹。
5. 通过在含有2mM EDTA的1ml冰冷的PBS中刮擦来分离细胞，并在4℃以1,500×g离心5分钟。
6. 将细胞沉淀重悬于0.5ml冰冷缓冲液A中，并通过微量离心管中的21号针头剪切30次。在1.5ml Eppendorf管中离心裂解物，在1,800×g，4℃下静置8分钟以除去体积核。保留30μl的裂解液用于Western印迹的ASC作为输入对照
7. 用缓冲液A以1:1的比例稀释剩余的上清液，并在4℃下以2,000xg离心5分钟。需要稀释来优化收获。
8. 离心后，收集并稀释上清液与1体积的CHAPS缓冲液，并以5,000×g离心8分钟，以沉淀ASC寡聚体。
9. 丢弃上清液并将沉淀重悬于50μl含有4mM二琥珀酰亚氨基辛酸酯（溶于DMSO中）的CHAPS缓冲液中。在室温下孵育30分钟以交联蛋白质。
10. 在4℃下以5,000×g离心8分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于30μl的2x蛋白质加载缓冲液中。在90℃下将样品加热2分钟注意：在此之前可以停止，并将蛋白裂解物冷冻至-20°C，然后继续使用Western印迹步骤。
蛋白质印迹分析
1. 组装15％SDS-PAGE。
  注意：具有7至8厘米迁移距离的15％凝胶足以给出ASC单体和低聚物的良好拆分。
2. 在15％SDS-PAGE上载入30μl重悬浮的含有ASC的沉淀物。（此样本应包含交联的低聚ASC）
3. 向步骤A6分离的30μl输入中加入30μl蛋白质加载缓冲液，在90℃下加热样品2分钟，并在15％SDS-PAGE上加载30μl。（此样本应包含输入ASC量）
4. 在恒定的160 V下分离，直到蛋白质加载缓冲液达到凝胶的末端。
5. 使用湿式转移系统在80 V下转移2 h。
6. 用蒸馏水冲洗膜。
7. 阻塞缓冲液中的膜在室温下搅拌1小时
8. 在4℃下孵育膜过夜，轻轻搅拌，用阻断缓冲液1：1,000稀释的抗ASC抗体
9. 用PBS-T（每次洗涤）洗涤膜3次10分钟。
10. 在室温下搅拌，在封闭缓冲液中孵育1小时，再用1：5,000稀释的二抗
11. 用PBS-T（每次洗涤）洗涤膜3次10分钟。
12. 去除多余的PBS-T。
13. 与ECL孵育并进行化学发光检测。

数据分析

ASC寡聚体的免疫反应带以对应于ASC单体，二聚体和更高级寡聚体的分子量出现。需要对每个条件的总细胞裂解物中ASC表达的阳性对照进行。可以包括其他用于相等蛋白质负载的阳性对照如微管蛋白。应进行三次独立实验。数据分析的一个例子可以在图1和（Di Micco等人，2016）的图3A中找到。在本研究中，永生化的骨髓来源的巨噬细胞（iBMDM）未经挑战（泳道1）或用NLRP3炎性体激活物尼尼西肽（泳道2）或AIM2炎性体激活剂聚（dA：dT）（泳道3）和奈非那韦（泳道4）进行攻击。在第一条泳道中，休息的iBMDM在颗粒状部分中没有显示ASC寡聚化。在泳道2,3和4中，用炎性体激活剂攻击的iBMDM在其交联的小球中表现出强烈的ASC寡聚化。

图1. BMDM用LPS引发，用载体，DMSO（Lane1）奈非那韦，（泳道2），脂质体（Lipo）（泳道3）Lipofectamine加聚（dA：dT）（泳道4）处理6小时，，如所示。将交联小球（Pell）或可溶性裂解物（Lys）免疫印迹为ASC或半胱天冬酶-1。关于实验的更多细节可以在Di Micco等人，2016中找到。

笔记

应将细胞培养上清液中的蛋白质沉淀并加载到15％SDS-PAGE上，以同时测定成熟IL-1β和半胱天冬酶-1切割至ASC寡聚化的释放。
所有刺激均在无血清的Opti-MEM中进行。在培养基中血清的存在会大大干扰从细胞培养上清液中沉淀的蛋白质的蛋白质印迹
LPS和尼可地霉素是有毒化合物，应小心处理。
将LPS以5μg/μl重悬于水中，并在-20℃下等分至少12个月。将尼日利亚钠盐以5mM的浓度重悬于EtOH中，并在4℃保存长达12个月。将甲磺酸奈非那韦以50mM重悬于DMSO中，并以等分试样在-20℃保存长达12个月。将聚（dA：dT）以1μg/μl重悬于H 2 O中，并以等分试样在-20℃下储存长达12个月。所有刺激物在刺激前立即从这些储备溶液中清新。

食谱

1x PBS
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH PO 4
成长媒体
RPMI 1640
10％FBS
1％青霉素 - 链霉素
缓冲区A
20mM HEPES-KOH，pH7.5
10 mM KCl
1.5mM MgCl 2
1 mM EDTA
1 mM EGTA
320毫克蔗糖
CHAPS缓冲区
20mM HEPES-KOH，pH7.5
5mM MgCl 2
0.5 mM EGTA
0.1 mM PMSF
0.1％CHAPS
4x蛋白加载缓冲液
50mM Tris-HCl，pH6.8
2％SDS
10％甘油
12.5 mM EDTA
0.02％溴酚蓝
注意：2x加载缓冲液是通过在蒸馏水中稀释4倍蛋白质加载缓冲液2x制成的，不含减少剂，如DTT或2-巯基乙醇。
15％SDS-PAGE
375 mM Tris pH 8.8
15％丙烯酰胺
1：1,000（v：v）TEMED
0.1％APS
堆叠凝胶
125 mM Tris pH 6.8
4.2％丙烯酰胺
1：1,000（v：v）TEMED
0.1％APS
迁移缓冲液SDS-PAGE
25mM Tris碱，pH 8.3
250mM甘氨酸
0.1％SDS
转移缓冲区
25 mM Tris碱基
190mM甘氨酸
20％乙醇
用HCl调节pH至8.3
PBS-Tween（PBS-T）
1x PBS
0.1％Tween-20
阻塞缓冲区
PBS-T
不含脂肪的干乳5％（w/v）

致谢

这项工作得到欧洲研究委员会起草授权281996的支持，并由（Di Micco等人，2016年）改编而成。

参考

Dick，MS，Sborgi，L.，Ruhl，S.，Hiller，S.和Broz，P。（2016）。 ASC细丝形成用作炎症信号的信号放大机制。 7：11929.
Di Micco，A.，Frera，G.，Lugrin，J.，Jamilloux，Y.，Hsu，ET，Tardivel，A.，De Gassart，A.，Zaffalon，L.，Bujisic，B.，Siegert，，Quadroni，M.，Broz，P.，Henry，T.，Hrycyna，CA和Martinon，F。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/27462105"target ="_ blank"> AIM2炎症细胞被核包膜完整性的药理学破坏所激活。 Proc Natl Acad Sci USA 113（32）：E4671 -4680。
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Martinon，F.，Burns，K.和Tschopp，J。（2002）。炎症体：触发炎症半胱天冬酶激活和proIL-β的加工的分子平台。分子细胞<10>（2）：417-426。
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