材料和试剂

物料
1. 多孔板（细胞培养级）（Greiner Bio One International，目录号：662160）
2. 纤维素层析纸（180℃灭菌）（Whatman，目录号：3030-931）
3. 50ml离心管（细胞培养级）（Greiner Bio One International，目录号：210261）
4. 10 ml一次性移液管（Greiner Bio One International，目录号：607160）
5. 小鼠（C57BL/6，来自德国Charles River或内部养殖场的6周龄至1年）
6. 冰

试剂

	试剂	制造商	品牌	目录号	准备	等分试样	存储	库存浓度	工作集中	稀释
1	盐酸（HCl）1 N（无菌过滤）	Carl Roth		K025.1	1 L		RT		0.05 N	1ml HCl 1N + 19ml H 2 O，无菌
2	Dulbecco的PBS（DPBS）	Biowest		L0615-500	500 ml		4°C	1x	1x	未稀释的
3	70％EtOH（变性）	钍。盖尔		2270			RT
4	异氟烷	巴克斯特		KDG9623			RT
5	胶原酶/分散素（无菌过滤）	罗氏诊断		11097113001	500毫克/毫升H 2 O，无菌	200μl	-20°C	100毫克/毫升	1 mg/ml	100μl胶原酶/分散在10ml培养基中
6	DNase I	罗氏诊断		11284932001	100毫克/毫升H 2 O，无菌	100μl	-20°C	10毫克/毫升	4μg/ml	40μlDNase I在10ml培养基中
7	α-甲基-L-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐（TLCK）	Sigma-Aldrich		90182	14.7mg/10ml H 2 O，无菌	200μl	-20 °C	1.47 mg/ml稀释至14.7μg/ml	0.147μg/ml	100μlTLCK在10ml培养基中
8	霉素	Sigma-Aldrich		P8833	2.5mg/10ml H 2 O，无菌	500 μl	-20 °C	0.25 mg/ml	8μg/ml	32μl嘌呤霉素在1 ml培养基中
9	胰蛋白酶-EDTA 0.25％	赛默飞世尔科技	Gibco ^TM	25200-056	100 ml		-20 °C	1x	1x	未稀释的
10	4％多聚甲醛	默克·米利波尔		1040051000	DPBS中4％多聚甲醛		-20 °C
11	CD31	BD	BD Pharmingen	557355						1：500
12	α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）	Acris抗体			DM001-05
13	Iba1	和光纯药业			019-19741
14	胶质纤维酸性蛋白（GFAP）	EMD Millipore			AB5541
15	Zona occludens-1 （ZO-1）	赛默飞世尔科技	Invitrogen		40-2200
16	VE-Cadherin	Santa Cruz Biotechnology			sc-6458
17	Claudin-5（Cldn-5）	赛默飞世尔科技	Invitrogen		34-1600
18	Occludin（Ocln）	Sigma-Aldrich			SAB3500301
19	小鼠胶原蛋白，IV型	康宁			354233	890 mg/ml 0.05 N HCl	-80°C	890 mg/ml	50μg/ml	56μl胶原蛋白IV + 944μl0.05 N HCl
20	葡聚糖MW 60,000-90,000	阿尔法阿萨尔			J14495	1公斤	RT		18％	5.4 g葡聚糖在30 ml DPBS中
21	青霉素/链霉素（100x）	生物色素			A2212	100 ml	-20°C	100x	1x	100μlpen/strep在10ml培养基/葡聚糖中
22	L-谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	Gibco ^TM		25030024	100 ml	-20°C	200 mM（100x）	2 mM（1x）	100μlL-谷氨酰胺在10ml培养基中
23	DMEM-F12 w/o谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	Gibco ^TM		21331020	500 ml	4°C	1x	1x	未稀释的
24	DMEM w/o葡萄糖	赛默飞世尔科技	Gibco ^TM		11966025	500 ml	4°C	1x	1x	未稀释的
25	血浆衍生牛血清（PDS）	第一连接		60-00-810	500 ml	10毫升	-20°C	100％	20％	10 ml PDS在50ml培养基中
26	抗生素/抗真菌药（100x）	赛默飞世尔科技	Gibco ^TM	15240062	100 ml	1 ml	-20°C	100x	1x	100μlAA在10ml培养基/葡聚糖中
27	肝素钠	Ratiopharm		PZN 003029843	1安瓿		4°C	5,000 I.E./ml	750 I.E./50 ml	150μl肝素在50ml培养基中
28	内皮细胞生长补充剂（ECGS）	Sigma-Aldrich		E2759	15毫克/5毫升DPBS	500μl	-20°C	3 mg/ml	30μg/ml	500μlECGS在50ml培养基中
29	18％葡聚糖溶液（见配方）
30	工作介质（见配方）
31	消化培养基（参见食谱）
32	完整介质（见配方）

注意：小鼠胶原蛋白，IV型：在冰上，4℃下将霜冻缓慢清除过夜。彻底旋涡等分并储存于-80°C。胶原浓度因批次而异。因此，每个新批次必须调整添加的HCl量。

设备

冰箱（4°C）
振动器
无菌烧杯100-150毫升（180度消毒）
层流工作台
Dounce组织研磨机，15ml，高压釜（Sigma-Aldrich，目录号：D9938）
Scalpel
镊子（180°C灭菌）
离心机（Hettich Lab Technology，型号：UNIVERSAL 320 R），
固定角转子（Hettich Lab Technology，目录号：1620A）
大剪刀（180°C灭菌）
小型剪刀（180°C灭菌）
移液器或真空泵
水浴
微波炉

程序

准备（第1天） - 用胶原蛋白加油
1. 在冰箱（4℃）中冰上缓慢（2-3小时）除霜6孔板2孔或其他孔尺寸（见表1）的一个胶原等分试样
  如果需要，可以在冰箱中除冰等分试样，无冰。
  
  表1.根据井号调整体积
2. 用0.05N HCl将胶原蛋白稀释至50μg/ml 注意：0.05 N HCl等分试样可以在-20°C储存。
3. 彻底旋涡至少10秒钟，直到形成小气泡（转动管，以确保粘性胶原蛋白原液不会持续粘在底部）。
4. 用胶原蛋白溶液均匀涂抹（体积见表1）
5. 将板放在振荡器上，室温1小时，25rpm
6. 将板移动到4°C进行存储（可能过夜）。
  注意：也可以在内皮细胞制备当天涂上平板。
隔离（第2天）
1. 准备工作：
  1. 冰
  2. 仪器灭菌
  3. 约。 50毫升DPBS在冰上150毫升无菌烧杯（每个样品）
  4. 在冰上的无菌烧杯中（约150ml无菌烧杯中的约50ml）消毒剂（70％EtOH）
  5. 打开层流，制备纤维素层析纸，组织研磨机，手术刀，镊子和50ml离心管（每个样品一个）。
  6. 预冷离心机至4°C
2. 根据当地的动物规定麻醉老鼠。我们使用过量的异氟烷，这会在一分钟内导致呼吸停止。用大剪刀取下鼠标，将头浸于乙醇（冰上）。迅速取出大脑（图1A）并将其存放在DPBS上。重复所有的大脑。
  1. 切断小脑和嗅球。
  2. 使用钝镊子在纤维素层析纸上滚动脑部去除脑膜。
  3. 切割大脑2至4片，将片放在5ml工作介质（4℃）中。重复所有大脑。
  4. 将大脑用5ml工作培养基（4℃）转移到组织研磨机（图1E）中，并匀化（雌蕊A为30次，雌蕊B为25次，图1F）。在一个组织研磨机中最多使用10个大脑。
  5. 将匀浆转移到50ml离心管中。用5ml工作介质（4℃）冲洗组织研磨机，并加入匀浆（共10ml）。
  6. 离心机在1,350℃，5分钟，4℃下匀浆。用移液器或真空泵小心取出上清液。
  7. 将沉淀重悬于15ml葡聚糖溶液中并大量旋转（2分钟）。结果是白色，多云，均匀的悬浮液（图1G）。
  8. 以6,080 x g，10分钟，4℃离心。同时，每10 ml消化培养基中加入100μl胶原酶/分散酶，40μlDNase I和100μlTLCK的消化培养基。预热消化培养基至37°C
  9. 离心后，尽可能地去除蓬松髓磷脂层（图1H和1I中的顶部，黑色箭头）和葡聚糖。使用10ml一次性移液器。如有必要，先取出移液器的过滤器。
  10. 在10ml消化培养基（37℃）中将沉淀（图1H和1I中的白色箭头）重悬。
  11. 在37℃水浴中将组织消化1小时15分钟（不时摇动2至3秒 - 约15分钟）。
  12. 以1,350×g离心细胞悬浮液，5分钟，室温。同时，从冰箱中取出预涂板，在离心管中加入无菌DPBS（每个样品10ml），并加热至37℃。补充完全培养基与嘌呤霉素并预热至37℃（见步骤B2q）
  13. 去除消化介质。
  14. 将沉淀重悬于10ml温热DPBS中
  15. 以1,350×g离心，5分钟，室温。同时，从涂覆的孔中除去胶原蛋白，并用DPBS洗涤两次。 DPBS从第二次洗涤留在井中，直到细胞准备播种
  16. 去除DPBS并将沉淀物重新悬浮在完全培养基中。对于6孔板，每孔2.5ml完全培养基，每孔1-2脑（每个培养板约4只脑）。
  17. 播种前仔细混合细胞悬液，以确保均匀分布。
  18. 加入嘌呤霉素，如表2所示。（可直接加入完整培养基，见步骤B2）
    表2.根据井尺寸的文化体积
    
    图1.用于制备脑的典型图像，去除脑膜，均匀化和随后的葡聚糖梯度离心。图像描绘了分离程序的第一步骤，其显示脑原位在去除骷髅帽（A）之前，（B.虚线所示的切割平面）和除去小脑，嗅球（C）和脑膜（D）之后。然后，在大脑组织研磨机（E）中收集脑，使其均质（F），并离心组织匀浆。接下来，将细胞重悬在葡聚糖溶液中并大量旋转（G）。离心后，所得髓鞘层位于顶部，血管碎片聚集在管底部的边缘（H + I，黑色箭头：髓鞘层，白色箭头：颗粒位置）。血管碎片颗粒的大小取决于所用脑的数量。在E-I中，两只脑被用于准备。
3. 第3天
  1. 用DPBS洗涤细胞两次。
  2. 更改完整媒介。
  3. 添加嘌呤霉素（或者，嘌呤霉素可以预先加入到完全培养基中）
4. 第4天
养殖
1. 每周更换1-2次，每次约1次。隔离后4-6天。
2. 如果细胞融合，分裂培养物1：2（或1：3）。使用胰蛋白酶5-10分钟，并用完全培养基灭活。
3. 板细胞和第二天更换培养基。
细胞培养物的纯度（图2和3）
内皮细胞（CD31 ⁺）> 95％
周细胞（α-SMA ⁺） 5％
无星形胶质细胞（GFAP ⁺），小胶质细胞（Iba1 ⁺），神经元（NeuN ⁺）

图2.原代小鼠脑内皮细胞的代表性免疫荧光图像细胞在分离后14天用4％多聚甲醛固定，随后染色为CD31（BD，1:500）作为内皮细胞特异性标记与α-SMA（周细胞和平滑肌细胞，Acris，1:200，上排），Iba1（小胶质细胞，和光纯药化学工业株式会社，中号行）和GFAP（星形胶质细胞，Millipore，1：400，较低行）。比例尺表示50μm。

图3.原代小鼠脑内皮细胞维持紧密和粘附连接蛋白的表达。细胞在用冰冷的甲醇分离后6-8天固定，随后染色紧密连接蛋白Ocln（Sigma- Aldrich，1:500），ZO-1（Thermo Fisher Scientific，1:500），Cldn-5（Thermo Fisher Scientific，1:500）和Adherens连接蛋白VE-钙粘蛋白（Santa Cruz Biotechnology，1:500）。比例尺表示50μm。

数据分析

通过该方法分离的原代小鼠脑内皮细胞可用于多种方法，包括蛋白质和基因表达分析，使用transwell插入片段进行跨内皮细胞耐药性评估，并进行迁移或粘附测定。此外，这些细胞也可以在涂覆有胶原IV的玻璃盖玻片上生长，用于活检成像，例如以监测细胞内钙动态。

笔记

该方案被开发用于从成年小鼠中分离脑内皮细胞。我们成功地从我们的实验室中分离和培养来自年轻小鼠（6-8周）和老鼠（长达1年）的细胞，而不对该方案进行任何修改。使用其他小鼠品系的大脑没有在我们的实验室进行测试。
细胞通常在6-8天内达到汇合（见图4）。他们可以维持文化，但最终在周末后长满周末。
大约10天后，细胞不像以前一样强烈地粘附，并且在染色过程中更可能分离

图4.分离后2天（左）或7天（右）初次鼠脑内皮细胞的明视野图像。注意培养2天后连接的血管片段及其径向成长的内皮细胞。比例尺表示100μm。

食谱

18％葡聚糖溶液（2份制剂）
通过加热（微波）将5.4g葡聚糖溶解在30ml DPBS中 300μl青霉素/链霉素（100x）
300μlL-谷氨酰胺（200 mM）
溶液可以储存在-20°C，使用前要除霜，但解冻后应加入青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺。
工作介质（2个准备）
20毫升DMEM-F12
200μl青霉素/链霉素（100x）
200μlL-谷氨酰胺（200 mM）
消化培养基（2个制剂）
20ml DMEM
200μl青霉素/链霉素（100x）
消化之前200μl胶原酶/分散 - 添加消化前200μlTLCK-添加消化前80μlDNase I添加即可
完全培养基（最高储存时间4周，4°C）
40毫升DMEM-F12
10 ml PDS
500μl抗生素/抗真菌剂（100x）
500μlL-谷氨酰胺（200 mM）
150μl肝素（5,000 U/ml）
500μlECGS

致谢

这里描述的协议已经基于Song and Pachter（2003）发表的方法进行了修改。我们要感谢Beate Lembrich的专家技术援助。这项工作由Deutsche Forschungsgemeinschaft（SCHW416/5-2,416/9-1）资助。

参考

Ridder，DA，Wenzel，J.，Müller，K.，Töllner，K.，Tong，XK，Assmann，JC，Stroobants，S.，Weber，T.，Niturad，C.，Fischer，L.，Lembrich，B ，Wolburg，H.，Grand'Maison，M.，Papadopoulos，P.，Korpos，E.，Truchetet，F.，Rades，D.，Sorokin，LM，Schmidt-Supprian，M.，Bedell，BJ，Pasparakis ，M.，Balschun，D.，D'Hooge，R.，Löscher，W.，Hamel，E。和Schwaninger，M。（2015）。脑内皮细胞TAK1和NEMO保护神经血管单位。 J Exp Med 212（10）：1529-1549。
Song，L. and Pachter，JS（2003）。维持紧密连接相关蛋白的表达和细胞骨架关联的鼠脑微血管内皮细胞的培养物。体外细胞发育生物学动画 39（7）：313-320。