材料和试剂

1.5ml管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
ZipTip ^®移液器吸头（Merck Millipore，目录号：ZTC18S096）
Pierce ^{TM旋转柱，螺帽（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：69705）}}
C18（FUJIGEL HANBAI，目录号：MB 100 - 40/75）
0.5M，pH 7.0（TCEP）（Sigma-Aldrich，目录号：646547）的三（2-羧乙基）膦盐酸盐溶液
甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：94318）
乙腈（Sigma-Aldrich，目录号：34851）
Rapi Gest SF表面活性剂（WATERS，目录号：186001861）
碘乙酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：I1149）
胰蛋白酶（Roche Diagnositics，目录号：11418025001）
磷酸氢二钾三水合物（K 2 HPO 4·3H 2 O）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
磷酸（H 3 3 PO 4）
氯化铵（Sigma-Aldrich，目录号：A9434）
盐酸（HCl）
0.5 M碘乙酰胺原料（见配方）
0.1μg/μl胰蛋白酶原料（见食谱）
50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.8（参见食谱）
100ml溶剂A（5mM NH 4 Cl，25％[v/v]乙腈，pH3.0）（参见食谱）
100ml溶剂B（500mM NH 4 Cl，25％[v/v]乙腈，pH 3.0）（参见食谱）

设备

2μl，10μl，100μl，1000μlPipetman（Gilson，France）
最佳MAX-XP超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optimal MAX-XP）
AKTA净化器-10（GE Healthcare，型号：AKTApurifier 10）
ISS 110 SpeedVac系统（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：ISS 110）
PolySULFOETHYL A ^{TM柱，2.1×200mm，5μm颗粒，300A孔（PolyLC，目录号：202SE05）}

软件

UNICORN 5.2软件（GE Healthcare，USA）

程序

血浆膜蛋白制备
1. 用100μl50mM磷酸钾缓冲液（pH7.8）悬浮质膜（PM）颗粒（根据Han等人，2010）分离。
  注意：推荐的PM蛋白浓度为1μg/μl。该方案设定100μgPM蛋白为例，因此使用100μl缓冲液悬浮颗粒。
2. 加入25μl1％（w/v）的Rapi Gest SF储备液至0.2％（w/v）的工作浓度，充分混合，然后在〜100℃下将混合物煮沸5分钟从PM溶解蛋白质。
  注意：RapiGest SF是一种酸不稳定变性剂（图1A），可以溶解和展开蛋白质，使其更易于切割（图1B）。推荐的RapiGest SF工作浓度为0.1％（w/v）。对于PM蛋白质，增加孵育时间（在37℃，至少1小时是安全的;在100℃，5分钟就足够了）或使用更高的RapiGest SF浓度（高达0.5％[w/v]是安全的）使以下消化更有效率。
  
  图1. Rapi的工作原理 Gest SF表面活性剂。 A. Rapi Gest SF可以通过酸化容易地分解，然后通过离心除去。 B. Rapi Gest SF是一种温和的变性剂，其使蛋白质更适合于切割而不破坏内切蛋白酶活性。图片是从Waters官方网站下载的：（ http://www.waters.com/waters/en_US/RapiGestSFSurfactant/nav.htm?locale=/&cid=1000941 ）
3. 将混合物冷却至室温（RT）以进行以下消化。
血浆膜蛋白消化
1. 减少：向蛋白质混合物中加入2.5μl0.5M TCEP，pH7.0至10mM的工作浓度，轻轻混合，然后在56℃温育1小时。
2. 烷基化：将混合物冷却至室温，并加入14μl0.5M碘乙酰胺原液至50mM的工作浓度，轻轻混合，然后在室温，暗处孵育45分钟。
3. 消化：向蛋白质混合物中加入20μl0.1μg/μl胰蛋白酶原料，工作浓度为1:50（w/w），轻轻混合，然后在37℃下孵育12小时。
4. 酸化：向混合物中加入0.5μl甲酸至工作浓度为0.2-0.5％（v/v）（pH <2），37℃孵育30-45分钟，然后在4℃离心20,000 xg 20分钟，以移除 Gest SF。排出小丸，将上清液转移到新管上
5. 脱盐：使用C18填充的旋转柱浓缩和纯化肽混合物注意：如果肽混合物小于5.0μg，请使用ZipTip ^®移液管进行脱盐。
6. 将纯化的肽混合物放入SpeedVac系统中冻干以进行以下分级分离。
肽混合物分馏
以下协议由Zhu等人修改。（2009年）。它在具有强阳离子交换（SCX）PolySULFOETHYL A ^TM列的AKTA净化器-10系统上进行。
1. 将冻干的肽混合物重新悬浮在溶剂A中
2. 运行溶剂B 20分钟，然后通过AKTA净化器-10系统溶剂A 30分钟，以平衡PolySULFOETHYL A ^TM柱。
3. 加载悬浮肽并以200μl/min的流速运行以下梯度，每2分钟收集一次产品。
  0-5分钟：100％溶剂A
  5-95分钟：0-60％溶剂B
  95-115分钟：60％-100％溶剂B
  115-145分钟：100％溶剂B
  145-155分钟：100％溶剂A
4. 运行ddH 2 O 20分钟，然后运行100％乙腈10分钟以存储色谱柱。
5. 根据214 nm紫外吸收峰积分产品（图2）
  
  图2.来自水稻成熟花粉颗粒的肽混合物的SCX分级。根据214nm UV吸收峰，可以将肽混合物合并成14个级分用于LC-MS/MS分析。 >
6. 使用C18旋转柱或ZipTip ^®移液器尖端净化组合的产品。
7. 对纯化产物进行冻干以进行质谱鉴定。

数据分析

通过UNICORN 5.2软件（GE Healthcare，USA），通过其214nm UV吸收峰监测SCX分离的肽。

笔记

在SCX分馏后，转化后的肽含有高浓度的盐。不要忘记通过C18旋转柱或ZipTip ^®移液器尖端进行脱盐程序，否则将影响以下质谱鉴定。

食谱

1％（w/v）Rapi Gest SF股票
将1mg冻干的Rapi/Gest SF粉末溶于100μlddH 2 O中，储存在-20℃下。
0.5M碘乙酰胺原料
将46mg碘乙酰胺粉末溶于500μlddH 2 O中，立即使用
0.1μg/μl胰蛋白酶库存
将25μg胰蛋白酶粉末溶于250μlddH 2 O中，储存在-20℃下。
200毫升50毫克磷酸钾缓冲液，pH 7.8。
2.072g K 2 HPO 4·3H 2 O
0.125g KH 2 PO 4
填充高达200毫升与ddH 2 O
用H 3 PO 4将调节至7.8
100ml溶剂A（5mM NH 4 Cl，25％[v/v]乙腈，pH3.0）
0.027g NH 4 Cl
25ml乙腈
用ddH 2 O
填充100 ml 用HCl调节pH至3.0
100ml溶剂B（500mM NH 4 Cl，25％[v/v]乙腈，pH 3.0）
2.675g NH 4 Cl
25ml乙腈
用ddH 2 O
填充100 ml 用HCl调节pH至3.0

致谢

这个协议主要是从Han等人修改的。（2010），杨和王（2017）。这项工作得到了中国科技部（授权号：2013CB945101）和中国博士后科学基金（授权号：2016M591284）的支持。

参考

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Han，B.，Chen，S.，Dai，S.，Yang，N。和Wang，T。（2010）。用于相对和绝对定量的比较蛋白质组学的等压标签揭示了百合花粉花粉粒和花粉管的质膜相关蛋白质组的特征， em> .J Integr Plant Biol 52（12）：1043-1058。
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