材料和试剂

P10，P20，P200和P1000移液器的移液器提示
微量离心管（1.5 ml）
0.6 ml管
PCR管（0.2ml）
培养皿
T25培养瓶
离心管（15 ml）
电穿孔试管0.4厘米间隙（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652081）
Cas9/pTREX-n载体（Addgene，目录号：68708）（Lander等人，2015）
pUC_sgRNA载体（Addgene，目录号：68710）（Lander等人，2015）
pMOTag23M载体（Oberholzer等人，2006）
pMOHX1Tag4H载体（Lander等人，，2016b）
化学合格的大肠杆菌DH5α细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，购买目录号：18265017）（储存温度：-80℃）
吨。 cruzi Y株
Platinum
Miniprep试剂盒（Wizard ^® Plus SV Minipreps DNA纯化系统）（Promega，目录号：A1460）
来自琼脂糖凝胶的DNA提取试剂盒（Wizard ^® SV Gel和PCR Clean-Up System）（Promega，目录号：A9281）
（New England Biolabs，目录号：R0136S）（储存温度：-20℃）
南极磷酸酶（New England Biolabs，目录号：M0289S）（储存温度：-20℃）
琼脂糖（Promega，目录号：V3125）
1 kb加梯子
T4 DNA连接酶（Promega，目录号：M1801）（储存温度：-20℃）
2x快速连接缓冲液（Promega，目录号：C6711）（储存温度：-20℃）
LB肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3022）
LB琼脂培养液（Sigma-Aldrich，目录号：L2897）
氨苄西林钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A0166）
GoTaq G2 Flexi DNA聚合酶（Promega，目录号：M7805）（储存温度：-20℃）
乙醇
DNA寡核苷酸，脱盐纯度（Exxtend Biotecnologia Ltda。，Campinas，Brazil）
DNA超极寡核苷酸，纯度HPLC（Exxtend Biotecnologia Ltda。，Campinas，Brazil）
乙酸
苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
热灭活胎牛血清（FBS）（Vitrocell Embriolife，目录号：S0011）（保存温度：-20℃）
青霉素（10,000 U/ml）/链霉素（10mg/ml）储液（Vitrocell Embriolife，Campinas，Brazil）（储存温度：-20°C）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4
G418二硫酸盐（KSE Scientific，目录号：6483-TB-2G-001-5）
嘌呤霉素二盐酸盐（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：A1113803）}
潮霉素B（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10687010）}
抗HA高亲和力大鼠单克隆抗体（克隆3F10）（Roche Diagnostics，目录号：11867423001）
单克隆抗α-微管蛋白抗体（克隆B-5-1-2）（Sigma-Aldrich，目录号：T5168）
HA表位标签单克隆抗体（克隆2-2.2.14）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：26183）
兔抗HA多克隆抗体（Y-11）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-805）
抗c-Myc单克隆抗体（克隆9E10）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-40）
兔抗c-Myc多克隆抗体（N-262）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-764）
二甲基亚砜（DMSO）
氢氧化钠（NaOH）
氯化钠（NaCl）
氯化钾（KCl）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
肝输液汤（BD，Difco，目录号：226920）
胰蛋白酶^TM蛋白胨（BD，BBL，目录号：211921）
Hemin（Sigma-Aldrich，目录号：H9039）
氯化钙（CaCl 2）
磷酸二氢钾（K 2/2 HPO 4）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
乙二胺四乙酸（EDTA）
三碱基
SOC培养基（Sigma-Aldrich，目录号：S1797）
醋酸钠
sgRNA扩增PCR反应混合1次反应（见配方）
菌落PCR反应混合1次反应（见配方）
供体DNA PCR反应混合1次反应（见配方）
血红素溶液（见食谱）
LIT培养基（肝脏输注凝血酶）（见食谱）
电穿孔缓冲液（Cytomix），pH 7.6（参见食谱）
1×TAE（Tris-acetate-EDTA）缓冲液，pH 8.3（参见食谱）

设备

移液器（Gilson，Pipetman ，P10，P20，P200和P1000）
（28°C）（Shel Lab，型号：SSI5R）
搅拌孵育器（37°C）（Gallemkamp，型号：IOI400.XX2.C）
电泳室（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-Sub Cell GT Cell）
图像数字化仪（UVITEC，型号：Alliance 2.7）
NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：NanoDrop ^TM 2000c）}
微量离心机（Eppendorf，型号：5418）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
电生理器（Bio-Rad Laboratories，型号：Gene Pulser Xcell ^TM电穿孔系统）
Neubauer室（Sigma-Aldrich，型号：Bright-Line ^{TM血细胞计数器，目录号：Z359629）}
生物安全柜（Labconco，型号：Class II A2，Purifier Cell Logic ⁺）
高压灭菌器

软件

DNAMAN软件版本7.212（Lynnon Corporation）
Alliance 1D软件（UVITEC）

程序

Protospacer选择
1. 在TriTrypDB数据库上搜索感兴趣的克氏锥虫基因的基因组DNA序列（ http://tritrypdb.org/tritrypdb/），并使用序列检索工具下载该序列加上终止密码子下游200个核苷酸。
2. 选择靶向该基因的3'末端的原始区域，以在接近终止密码子的位点（从终止密码子上游20nt到终止密码子下游50nt）的Cas9核酸酶诱导双链断裂。原始区域是sgRNA上的20-nt碱基配对序列。为了靶向模板DNA链，在转录的基因序列中搜索5'-N（20）-NGG-3'。 N（20）对应于原始空间。 NGG是由Cas9核酸内切酶识别的原始相邻基序（PAM）序列。或者，为了靶向非模板DNA链，在转录的基因序列中搜索5'-CCN-N（20）-3'。 N（20）的反向互补序列将用作原始样品。选择最接近的终止密码子原始标记（最好在目标基因的开放阅读框下游），并验证其不会在克氏锥虫基因组上产生Cas9缺失定位。这可以使用如EuPaGDT（真核病原体CRISPR指南RNA设计工具， http ：//grna.ctegd.uga.edu/）或为此目的设计的特定脚本（Sidik 等人，，2014）。图1显示了用于TcVP1 （空泡质子焦磷酸酶编码序列）的基因标记的原始样品选择的实例。
  
  图1.选择原生质体和同源区域进行内源性标记 TcVP1 （ TriTrypDB 基因ID：TcCLB.510773.20）。原理图显示了TcVP1的基因组DNA序列，包括起始密码子（ATG，粗体序列），终止密码子（TGA，红色序列），以黑色下划线的选择的原始分子，分别以橙色和绿色下划线的原始相邻基序（PAM，蓝色序列）和同源区域1（HR1）和2（HR2）其被包括在DNA供体分子中以通过同源重组诱导DNA修复。剪刀表示Cas9切割位置。
sgRNA扩增
1. 为要扩增的每个sgRNA设计一个特异性正向引物，将原始序列N（20）插入以下引物主链：5'-GATC GGA TCC -N（20 ）-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3' 。用于扩增sgRNA的常见的反向引物序列是：5'-CAGTGGATCC AAAAAAGCACCGACTCGGTG-3'。这些引物中的每一个含有以粗体表示的限制性酶切位点。
2. 通过使用设计的特异性正向引物，常见的反向引物和质粒pUC_sgRNA作为模板通过PCR扩增sgRNA（配方1）。使用Platinum > Taq DNA聚合酶的高保真度的PCR条件：
  
  保持温度在10°C。产品PCR大小：122bp。
3. 使用向导^® SV Gel和PCR清理系统清除PCR产物。
sgRNA克隆到Cas9/pTREX-n载体中
1. 通过在37℃下孵育过夜，分别将1μg插入DNA（sgRNA纯化的PCR产物）和1μgDNA载体（Cas9/pTREX-n）与Bam HI限制酶（20U）分开。
2. 通过加入5 U的南极磷酸酶和10倍的南极磷酸酶缓冲液（终浓度为1倍）使消化的载体脱磷酸化，并在37℃下孵育15分钟。立即灭活磷酸酶，在70℃下孵育反应5分钟。
3. 通过使用1×TAE缓冲液中的1.5％制备型琼脂糖凝胶电泳解析消化产物，并使用Wizard（SEQ ID NO：2）向对照插入片段（sgRNA，122bp）和载体（Cas9/pTREX-n，11,173bp） sup> SV凝胶和PCR清洁系统（图2）
  
  图2.用BamHⅠ限制酶消化的DNA片段，并在DNA提取前用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离。泳道：1）sgRNA，2）1kb加梯，3）Cas9/pTREX-n线性化载体。分子量显示在左侧。要提取的片段用箭头表示。
4. 使用NanoDrop分光光度计定量分离的DNA片段。
5. 通过在0.6ml管中混合以下试剂进行连接反应：100ng载体和22ng插入物（20:1插入物与载体摩尔比），T4 DNA连接酶（3U），2x快速连接缓冲液最终反应体积），并用超纯水将终体积达到10μl。将反应在4℃下孵育过夜。
6. 使用5μl连接产物转化化学感受态的DH5αE。标准热休克转化方案后的大肠杆菌细胞。
7. 在补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂平板上铺展细胞，并在37℃下孵育过夜。
8. 通过手动取出单个菌落并将其重悬于5μl超纯水作为模板，在0.2ml管中进行菌落PCR。使用设计用于扩增sgRNA的特异性正向引物和HX1反向引物5'-TAATTTCGCTTTCGTGCGTG-3'（方法2）。使用GoTaq G2 Flexi DNA聚合酶的菌落PCR条件：
  
  将温度保持在10°C。
  以正确方向插入sgRNA的阳性克隆扩增了190bp的条带（图3）
  
  图3.从将sgRNA克隆到Cas9/pTREX-n载体中获得的菌落的PCR分析从阳性克隆（泳道3,4和6）扩增出190bp的片段，而同一条带阴性克隆缺失或非常弱（泳道2和5）。 1号加上梯子加载在1号线。分子量显示在左侧。
9. 通过使用HX1反向引物测序确认阳性克隆中sgRNA的方向。这些克隆对应于构建sgRNA/Cas9/pTREX-n（图4）
  
  图4.通过插入特异性sgRNA序列通过 Bam 导入来自载体Cas9/pTREX-n的分子构建体sgRNA/Cas9/pTREX-n的限制性图谱/em> HI限制站点。肋骨。促进核糖体启动子; HX1和gapdh是先前描述的（Vazquez和Levin，1999）; AmpR，氨苄青霉素抗性基因;新霉素抗性基因; Cas9-HA-2xNLS-GFP是编码Cas9核酸内切酶的融合基因，如前所述（Lander等人，2015）。
10. 选择一个阳性克隆，通过Miniprep分离足够的质粒DNA至少3次转染（〜100μg）
11. 通过加入1.5体积的100％乙醇和0.1体积的3M乙酸（pH5.2）沉淀约100μg质粒DNA。在-20℃下孵育过夜。在4℃以最大速度离心质粒DNA 30分钟，除去上清液并加入1ml 70％乙醇。应用涡旋15秒，再次以最大速度离心5分钟。去除上清液，空气干燥DNA沉淀（不要过度干燥以促进DNA再悬浮）。将DNA重悬于50μl超纯水中。
12. 使用NanoDrop分光光度计量化质粒DNA
DNA供体扩增
1. 设计超载体通过同源定向修复扩增用于基因标记的DNA盒。首先，选择位于目标基因终止密码子上游100bp的区域（同源区域1或HR1）。选择位于原始细胞Cas9切割位点下游的第二个100bp同源区（HR2）。 Cas9在PAM序列上游切割3个核苷酸（图1）。确定HR2（HR2rc）的反向互补序列。正向超级超声波将如下：5'-HR1-GGTACCGGGCCCCCCCTCGAG-3'。反超晶体将如下：5'-HR2rc-TGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGAT-3'。
2. 使用pMOHX1Tag4H载体（对于3xHA标记和潮霉素抗性，图5A）或pMOTag23M载体（对于3xc-Myc标记和嘌呤霉素抗性，图5B）扩增含有标签序列的DNA供体和抗生素抗性标记，加上100bp同源臂，作为模板（配方3）。进行足够的PCR反应以达到500-1,000μlPCR产物。使用GoTaq G2 Flexi DNA聚合酶的PCR条件：
  
  图5.用于在克氏锥虫中产生内源性C末端标签的策略的示意图。 ：一种。 i）pMOTag-HX1-4H载体图。切片信号位于3xHA标签序列和赋予潮霉素（Hygro R）抗性的基因之间。 HR1 Fw和HR2 Rv ultramers表示用于扩增DNA供体盒的寡核苷酸。 pMOTag-HX1-4H和基因组DNA（gDNA）的超临界退火区域分别以黑色和蓝色表示。 ii）由内源基因座中目的基因（GOI）的末端密码子下游的3'末端sgRNA/Cas9/pTREX质粒表达的sgRNA靶向的Cas9产生双链gDNA断裂。诱导同源定向修复与DNA供体盒共转染epimastigotes，含有GOI 3'端（蓝色）和GOI 3'UTR（浅蓝色）的同源区。 iii）通过同源重组在GOI的3'末端整合3xHA和抗生素抗性基因。箭头表示用于检查供体DNA整合的引物。 B. i）pMOTag23M矢量图。 3xc-Myc标签序列和嘌呤霉素抗性基因（Puro R）通过T分离。 brucei 微管蛋白基因间区（Tigr）。 i），ii）和iii）的其余部分与A组相似。Hygro，潮霉素抗性基因;普罗，嘌呤霉素抗性基因; UTR，5'和3'非翻译区; ATG，起始密码子。这个数字最初发表在Lander等人。，2016b。
3. 在琼脂糖凝胶上分析PCR产物。 PCR产物大小：1.5kb（使用pMOTag23M作为模板）（图6）或1.6kb（使用pMOHX1Tag4H作为模板）
  
  图6.从载体pMOTag23M扩增的DNA供体（1.5kb），并在1％琼脂糖凝胶上显泳（泳道2）。 1栏加上梯子加载在泳道1中。分子量显示在左侧。
4. 通过在1.5ml管中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）纯化500-1,000μlPCR产物，然后施加涡旋1分钟，以最大速度离心2分钟，小心地转移上清液放入新的1.5 ml管中。
5. 通过加入1.5体积的100％乙醇和0.1体积的3M乙酸（pH5.2）沉淀DNA供体。在-20℃下孵育过夜。在4℃以最大速度离心DNA供体30分钟，除去上清液并加入1ml 70％乙醇。应用涡旋15秒，再次以最大速度离心5分钟。去除上清液，空气干燥DNA沉淀（不要过度干燥以促进DNA再悬浮）。将DNA重悬于50μl超纯水中
6. 使用NanoDrop分光光度计量化DNA供体。
细胞培养
1. 文化T cruzi在28℃下含有10％热灭活的FBS和青霉素（100U/ml）/链霉素（100μg/ml）的肝输注柠檬酸（LIT）培养基（配方4）中的应答epimastigotes（骨和Steinert，1956）。
2. 确定T细胞密度。 cruzi 文化通过在Neubauer室中计数细胞。 吨。 crizi epimastigotes应在生物安全柜中操纵。
细胞转染
1. 共转染cruzi epimastigotes与sgRNA/Cas9/pTREX-n质粒和DNA供体盒用于基因标记。一式两份进行转染。
2. 成长。克氏佐剂，以1×10 7细胞/ml的密度进行表达。
3. 在室温下在PBS pH 7.4中洗涤细胞一次。
4. 在冰冷的细胞模型（Recipe 5）中以1×10 8个细胞/ml的密度重悬细胞。
5. 在冰冷的0.4厘米电穿孔比色皿中混合0.4毫升细胞悬液与25μgsgRNA/Cas9/pTREX-n质粒和25μgDNA供体（每个最大体积为20μl的DNA）。作为电穿孔的对照，将10μl超纯水加入到一个细胞池中，不再添加到另一个细胞池中。
6. 将细胞置于比色皿中冰上10分钟，然后使用设置为1.5 kV和25μF的Bio-Rad Gene Pulser Xcell ^{TM系统进行电穿孔，3个脉冲，在脉冲之间在冰上留下比色皿1分钟。视频1显示了本协议中描述的标准电穿孔程序}
7. 让细胞在比色杯中在室温下恢复15分钟。
8. 将细胞转移到补充有20％热灭活的胎牛血清的5ml LIT培养基中，并在28℃下孵育。
9. 24小时后，加入抗生素进行选择。先前应针对每个特定的T优化抗生素浓度。 cruzi 菌株。对于Y菌株，细胞系应保持在含有250μg/ml G418和5μg/ml嘌呤霉素（3xc-Myc标记）或250μg/ml G418和350μg/ml潮霉素（3xHA标记）的培养基中。
10. 在选择抗性细胞期间（通常为4-5周），在补充有20％FBS的LIT培养基中维持寄生虫。在此期间，通过离心寄生虫，去除上清液并加入含有20％FBS和抗生素的新鲜培养基，每周更换一次培养基。以这种方式，寄生虫不会被稀释直到达到1-2×10 7细胞/ml的细胞密度。此时，培养基中的FBS浓度可以降低到10％，通常可将细胞稀释以进行维持。