材料和试剂

60mm细胞培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：CLS430166）
制造：康宁，目录号：430166。
硅烷制备载玻片：涂有硅烷（氨基烷基硅烷）的玻璃载片（Sigma-Aldrich，目录号：S4651）
HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2）
细胞培养
1. 罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：61870010）}
2. 10％胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10270106）}
3. 青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15070063）}
4. 0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200056）
注意：将HeLa细胞在补充有10％FBS，1μg/ ml青霉素和1μg/ ml链霉素（定义为“完全培养基”）的RPMI 1640中培养。
5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）（Sigma-Aldrich，目录号：I7125）
5-氯-2'-脱氧尿苷（CldU）（Sigma-Aldrich，目录号：C6891）
化学品分析等级
1. 甲醇（CARLO ERBA试剂，目录号：414814）
2. 乙酸冰川（Fisher Scientific，目录号：A38-212）
3. 乙醇绝对（CARLO ERBA试剂，目录号：308605）
4. 39.5％盐酸（HCl）（CARLO ERBA试剂，目录号：403878）
5. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
6. Tween ^{20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）}
7. ProLong ^{®金抗褪色试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：P36935）}}
8. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
9. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
10. 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：255793）
11. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：795488）
12. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：71725）
13. Tris（Roche Dignostics，目录号：10708976001）
14. 0.5M EDTA（pH8.0）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM9262）}
15. NP-40（Thermo Fisher Scientific，目录号：85124）
抗体
1. 抗BrdU克隆BU1 / 75（ICR1）（检测CldU）（Bio-Rad Laboratories，目录号：OBT0030CX）
2. 抗BrdU克隆B44（检测IdU）（BD，BD Biosciences，目录号：347580）
3. Alexa Fluor 488缀合的鸡抗鼠（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A21470）
4. Alexa Fluor 594-缀合的兔抗小鼠（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11062）
1x磷酸缓冲盐水（PBS）（见食谱）
扩展缓冲区（请参阅配方）
严格缓冲（见配方）

设备

孵化器
UVC 500 UV交联剂（GE Healthcare，型号：UVC 500）
离心机
共焦显微镜（例如，卡尔蔡司，型号：Zeiss LSM100）
通风柜

软件

GraphPad软件

程序

有关协议的概述，请参见图1

图1.协议原理图概述

在补充有10％FBS，1μg/ ml青霉素和1μg/ ml链霉素（定义为“完全培养基”）的RPMI 1640培养基中培养HeLa细胞。
在完整的RPMI 1640培养基（这些细胞被定义为“标记细胞”）处理具有CldU（20μM终浓度）的80％汇合HeLa细胞的60mm培养皿。而在相同条件下将未处理的相同细胞的另外60mm培养皿放置（这些细胞定义为“未标记细胞”）。在37℃下在5％CO 2培养箱中孵育两个培养皿20分钟（见注1）。
用1x PBS洗两次。
取出所有多余的1x PBS。
用UVC以10J / m 2的剂量处理标记的HeLa细胞（参见注2）。
在新鲜完整的RPMI 1640培养基中加入标记细胞IdU（终浓度为100μM）（参见注1）。
在37℃，5％CO 2培养箱中孵育40分钟
对标记的和未标记的HeLa细胞进行胰蛋白酶化，然后通过离心（800μg×5分钟）收获它们5分钟。
用冰冷（4℃）1x PBS洗涤细胞沉淀两次。
用2.5×10 5细胞/ ml的冰冷的1×PBS重悬细胞HeLa细胞。
用未标记的细胞稀释标记细胞1：8（vol / vol）。
点到硅烷准备载玻片上2.5μl该标记/未标记的细胞溶液。允许2.5μl样品不完全蒸发。（见注3）
将细胞与7.5μl扩散缓冲液直接混合在硅烷准备载玻片上
在室温（RT）下孵育10分钟
将幻灯片倾斜至15°，沿着长度铺展DNA纤维。
空气干燥DNA扩散。（见注3）
将DNA纤维（现在分散在硅烷制备载玻片上）在塑料或玻璃容器中的3:1甲醇/乙酸中，-20℃下固化15分钟。
在1x PBS中洗两次载玻片。
将DNA纤维在70％乙醇中于4℃孵育1小时（见附注4）
用2.5N HCl在37℃下处理载玻片1小时
用1x PBS洗涤载玻片两次。
在室温下用1x PBS + 0.5％BSA封闭DNA纤维30分钟。
使用1：500抗BrdU克隆BU1 / 75（ICR1）（其检测CldU）和1：300抗BrdU克隆B44（其检测IdU）在1×PBS + 0.5％BSA中在37℃孵育1小时。
在室温下洗涤DNA纤维两次5分钟，并在室温下用严格缓冲液（无需摇动）一次，持续15分钟
使用1：300的Alexa Fluor 488缀合的鸡抗鼠和1:400的Alexa Fluor 594-缀合的兔抗小鼠一起在1×PBS + 0.5％BSA中于37℃孵育Silane Prep载玻片30分钟。两种抗体均被单独测试以检测HeLa细胞中的可能的交叉反应性，并且之前成功地用于该技术（Alfano等人，2016）。
用1×PBS + 0.5％吐温20洗涤硅烷准备载玻片5分钟，室温3次
用ProLong Gold防褪色试剂装载幻灯片。
通过共焦荧光显微镜在顺序扫描模式下分析载玻片。

数据分析

为了处理从DNA纤维测定获得的图像（图2），可以使用手动计数或使用特定软件进行自动分析。为了分析各种DNA纤维类型（正在进行，新开发的或其他类型）的频率，我们为三个独立的每个实验手动计数600个纤维。为了评估通过DNA纤维测定评估的不同条件或治疗的统计学显着性，我们通过GraphPad软件进行了适当的统计检验。为了测量DNA扩展的长度以估计复制速度（1μm对应于2.59kb），我们使用特定的图像分析软件ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）。北卡罗来纳大学开发了一种用于DNA扩散自动分析的软件（ http://dnafiberanalysis.com / ）。

图2.使用该方案鉴定的代表性的DNA纤维种类。顺序标记提供不同DNA复制步骤的快照：1）正在进行的叉可以如（在单向进展的情况下）复制分支）或b中（在通过复制分支的双向进度的情况下）。 2）终止事件可以如（在复制起点的唯一绿线，其中DNA合成终止，而细胞仍然与第一标记进行孵育）或b（作为邻接的红 - 绿红色信号具有不同的趋势）。 3）新出现的起始物如图所示，如下图所示。这些来源在与第二个标记（根据本文所述的方案由唯一的红线组成）的温育期间被烧制。

笔记

CldU和IdU的脉冲时间和工作浓度可能需要根据研究中不同类型的细胞进行调整。
在将细胞暴露于紫外线灯泡之前，取下板盖，并确保完全吸出任何残留的细胞生长培养基或1x PBS，以免屏蔽UV辐射。
不要在通风橱中蒸发样品。
在该步骤中，载玻片可以在4℃下在70％乙醇中储存过夜，但是我们更喜欢直接处理纤维

食谱

1x磷酸缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH PO 4
调整到7.4的最终pH值
扩展缓冲区
0.5％十二烷基硫酸钠（SDS）
200mM Tris-HCl pH 7.4
50 mM EDTA pH 8
严格的缓冲区
10mM Tris-HCl pH 7.4
400 mM NaCl
0.2％吐温20
0.2％NP-40

致谢

我们感谢Sbarro健康研究组织（ http://www.shro.org ），人类健康基金会（ http://www.hhfonlus.org ），宾夕法尼亚州联邦和意大利人Asacciazione每la Ricerca sul Cancro（IG 2014-15690）的支持。 A.G.还是CROM的细胞周期和癌症研究线的主管，国立波斯尼亚人立陶宛工作室E La Cura Dei Tumori;那不勒斯。 F.P.也是美国宾夕法尼亚州宾夕法尼亚州费城大学生物学系Temple大学副教授。

参考

Alfano，L.，Costa，C.，Caporaso，A.，Altieri，A.，Indovina，P.，Macaluso，M.，Giordano，A.and Pentimalli，F.（2016）。＆nbsp; NONO根据紫外线辐射来调节S相检查点。癌基因 35（5）：567-576。

Bensimon，A.，Simon，A.，Chiffaudel，A.，Croquette，V.，Heslot，F.and Bensimon，D。（1994）。＆nbsp; 通过移动界面对DNA的对准和敏感检测。科学 265（5181 ）：2096-8。

Branzei，D.和Foiani，M.（2009）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19482564”target =“_ blank” >复制应力的检查点响应。 DNA修复（Amst） 8（9）：1038-1046。

凯恩斯J.（1963）。细菌染色体和其复制方式如放射自显影所见。 J Mol Biol 6：208-13。

Hanahan D.和Weinberg，B.（2011）。癌症的标志：下一代。细胞 144（5）：646-674。

Huberman，JA和Riggs，AD（1968）。＆nbsp; On哺乳动物染色体中DNA复制的机制。 J Mol Biol 32（2）：327-41。

Jackson，DA和Pombo，A。（1998）。复制子簇是染色体结构的稳定单位：证据表明核组织有助于S细胞在人细胞中的有效活化和繁殖。 140（6）：1285-1295。

Kaufmann，WK（2010）。＆nbsp; 人类S检查点对UVC诱导的DNA损伤的反应。致癌作用 31（5）：751-765。

Merrick，CJ，Jackson，D.and Diffley，JF（2004）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14982920”target = “_blank”>在人类细胞中DNA损伤后可变化的复制动力学。 J Biol Chem 279（19）：20067-20075。