材料和试剂

移液器吸头（Corning，Axygen ^{®，目录号：T-1005-WB-C-L）}
0.22μm过滤器
6培养皿（SRL LIFE SCIENCES，目录号：30006）
文化瓶
1.5ml离心管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-R）
0.5ml管（Corning，Axygen ^{，目录号：14-222-292）}
96孔板（SPL生命科学，目录号：30096）
一次性塑料电池刮刀（SRL LIFE SCIENCES，目录号：90020）
细胞系：在目前的方案中，小鼠胶质细胞系N9已被使用，由印度国家脑研究中心（NBRC）Anirban Basu博士（Singh等人，2016年））。通过逆转录病毒转染原代小胶质细胞与禽类逆转录病毒MH2的v-myc或v-mil致癌基因开发N9细胞系。细胞在补充有10％FBS和1％青霉素 - 链霉素的DMEM / F12培养基中于37℃在5％CO 2培养箱中培养
DMEM / F12（Sigma-Aldrich，目录号：56498C）
碳酸氢钠
双蒸水
胎牛血清（FBS）（Genetix Biotech，Cell clone ^{TM，目录号：CCS-500-SA-U）}
青霉素 - 链霉素（Pen-Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10378016）}
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
Bradford试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
三氯乙酸（TCA）（Sigma-Aldrich，目录号：T6399）
邻苯二甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P1378）
乙基马来酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：E3876）
谷胱甘肽（GSH）（Sigma-Aldrich，目录号：G4251）
氧化谷胱甘肽（GSSG）（Sigma-Aldrich，目录号：G4376）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
磷酸氢二钾（K 2 N 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
磷酸氢二钾三水合物（K 2 HPO 4·3H 2 O）
EDTA二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：E5513）
注意：本产品已停产。
100％乙醇（Merck，目录号：1009831011）
甲醇（SRL实验室，目录号65524）
0.1M磷酸钾EDTA缓冲液（KPE缓冲液）（参见食谱）
50％三氯乙酸（见食谱）
邻苯二甲醛溶液（10mg / ml）（参见食谱）
0.4M乙基马来酰亚胺（参见食谱）
0.1 N氢氧化钠（见配方）

设备

1 ml和200μl移液器（Eppendorf）
台式离心机（Sigma-Zentrifuges，型号：Sigma 3-18KS）
酶标仪（BMG LABTECH，型号：FLUOstar Omega）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific＆amp; TM），型号：Forma ^{TM Steri-Cycle ^{TM sub> 2 孵化器）}}
超声波仪（Sonics＆amp; Materials，型号：VC 505）

软件

火星数据分析软件1.01（酶标仪数据分析软件）

程序

程序流程图（图3）

图3.用于估计小鼠小胶质细胞系中的谷胱甘肽的程序的流程图，N9

媒体准备和细胞培养
1. 对于1L培养基，将12g DMEM / F12，2.44g碳酸氢钠溶解在890ml双蒸水中，然后加入100ml FBS以及10ml Pen-Strep。最后，通过0.22μm过滤器过滤介质。
2. 在6孔培养板中以1×10 6个/ ml的密度接种N9细胞，并在完全培养基（补充有10％FBS的DMEM / F12培养基）中生长16-18小时和1％Pen-Strep）。
3. N9细胞每48小时传代，解冻后直至6-7代。
注意：如果给予任何治疗，请确保治疗的剂量和持续时间对细胞无毒。＆nbsp;
细胞收获和裂解
1. 取出培养基并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。向每个孔中加入冰冷的0.1M磷酸钾缓冲液（KPE缓冲液，1ml），借助于细胞刮板将细胞从培养瓶的表面移出，并收集在1.5ml离心管中。
2. 在4℃将细胞悬浮液以350g离心5分钟。
3. 将得到的细胞沉淀物重新悬浮于具有1％蛋白酶抑制剂混合物（PIC）的200μlKPE缓冲液中，并通过超声处理5秒脉冲在25W下在冰上裂解两次。
注意：细胞刮除器是优选的，而不是酶解离以最小化处理时间。此外，为了酶解离，细胞需要在37℃下孵育，同时使用冰冷的缓冲液，同时使用刮板器，这在制备细胞裂解物期间是期望的，以保持蛋白质的结构和功能不变。
蛋白质样品制备和评估
超声处理后，将裂解的样品在4℃以18,000×g离心10分钟，将得到的上清液收集在单独的预冷却的1.5ml离心管中。
将10μl样品保存在0.5 ml管中，用Bradford试剂进行蛋白质评估。
蛋白沉淀
蛋白质估计后，10μg蛋白质样品沉淀。最初将80μl蛋白质样品与20μl三氯乙酸（TCA）（50％储备浓度）混合，涡旋并保持在冰中10分钟。将具有TCA的蛋白质样品在4℃下以9,100×g离心10分钟，将上清液转移到新鲜的1.5ml离心管中。
GSH和GSSG估计
1. GSH估计
  将10μl上清液与黑色96孔板中的等体积的OPT（1mg / ml）和180μlKPE缓冲液（pH-8）混合。
2. GSSG估计
  1. 将50μl上清液转移到新的离心管中，加入0.5μlN-乙基马来酰亚胺（储备浓度：4M），并充分混合。
  2. 在室温下孵育30分钟以抑制GSH。
  3. 在黑色96孔板中加入10μl该样品，10μlOPT和180μl0.1N NaOH（pH-12）。
    注意：使用多通道移液器将OPT和KPE缓冲液混合物添加到96孔板中以最小化时间流逝。
在室温下在黑暗中孵育10分钟。
在酶标仪中测量λ<λ> 355nm和λ 420nm处的荧光。

数据分析

标准准备GSH和GSSG
在KPE缓冲液中以1mg / ml的浓度制备GSH和GSSG储备溶液，并稀释100倍至10μg/ ml。将800μl的10μg/ ml溶液与200μlKPE缓冲液混合，使标准GSH和GSSG浓度为26.4nmol / ml。从该浓度，在KPE缓冲液中制备一系列两倍连续稀释度为（13.2nmol / ml，6.6nmol / ml，3.3nmol / ml至0.103nmol / ml）。
计算未知样品中的蛋白质浓度
蛋白质浓度由公式Y = mX + c的标准曲线确定（图4A和4B）。

图4.蛋白质浓度的计算 A. BSA的标准曲线; B.用于计算未知样品中蛋白质浓度的方程。
计算未知样品中的GSH和GSSG
来自样品的GSH和GSSG的浓度由其各自的标准曲线由式Y = mX + c计算（图5A和5B）。该测定可以检测10ng至2μg的GSH和5ng至2μg的GSSG

图5. GSH和GSSG浓度的计算（A）GSH的标准曲线; （B）GSSG和（C）用于计算未知样品中GSH / GSSG浓度的方程式。
规范化
GSH和GSSG浓度除以反应中使用的蛋白质量（每个样品10μg蛋白质）。数据以μmole/ mg蛋白表示。

食谱

0.1M磷酸钾EDTA缓冲液（KPE缓冲液）
注意：KPE缓冲区是由两种不同的解决方案A和B。
溶液A：将0.68g KH 2 PO 4在50ml dH 2 O中溶解
溶液B：溶解0.85克K 2 HPO 4或1.14克K 2 HPO 4·3H 2 O 2在50ml dH 2 O中的溶液如果不立即使用，溶液A和B都可以在4℃下储存。使用前0.1M KPE缓冲液通过将8ml溶液A与42ml溶液B混合并将pH调节至8来制备。最后将0.16g EDTA二钠盐加入到磷酸钾缓冲液中并充分混合以制备磷酸钾EDTA缓冲液
50％三氯乙酸（10ml）
称量5g三氯乙酸，并立即与dH 2 O immediately immediately混合用dH <2> O
调节体积至10ml
邻苯二甲醛溶液（10mg / ml）
通过将10mg邻苯二甲醛与1ml甲醇混合来制备邻苯二甲醛溶液溶液可以在黑暗中保存在4°C至1周
0.4M N - 乙基马来酰亚胺
将50mg N-乙基马来酰亚胺溶于1ml 100％乙醇中以制备0.4M NEM溶液。它可以在4°C存储1个星期
0.1N氢氧化钠
将0.04g氢氧化钠颗粒溶解在10ml dH 2 O中以得到0.1N溶液

致谢

这项工作得到CSIR-12th 5年网络项目“健康，疾病与环境毒性综合NextGen方法”（INDEPTH-BSC001）的支持。 V.S.获得CSIR高级研究奖学金的支持。 R.G.和M.P.教资会资助高级研究奖学金。作者声称没有竞争的经济利益。 CSIR-IITR手稿编号为3440.该方案已经从题为“用于测定组织中氧化和还原型谷胱甘肽的荧光测定方法”的文献得到遵循和修改。 Anal Biochem 74（1）：214-226“。

参考

Cohn，V.H和Lyle，J.（1966）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0003269766902867”target =“_ blank “>用于谷胱甘肽的荧光测定法。 14（3）：434-40。
Hissin，PJ和Hilf，R。（1976）。＆nbsp; 用于测定组织中氧化和还原型谷胱甘肽的荧光测定法。。 74（1）：214-26。
Rahman，I.，Kode，A.and Biswas，SK（2006）。＆nbsp; 使用酶再循环方法定量测定谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物水平的测定。 Nat Protoc 1（6）：3159-65。

Singh，V.，Gera，R.，Kushwaha，R.，Sharma，AK，Patnaik，S.and Ghosh，D。（2016）。＆nbsp; 无机砷劫持小胶质细胞谷胱甘肽通过细胞外胱氨酸/谷氨酸盐失衡推动未成熟神经元的旁观者死亡。 em> 6：30601.