材料和试剂

10-100μl移液器吸头（例如，Greiner Bio One International，目录号：685280）
100-1,000微升移液管吸头（例如，Greiner Bio One International，目录号：686290）
PCR管（例如，Greiner Bio One International，目录号：683201）
p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t（Addgene，catalog number：43803）
p414-TEF1p-Cas9-CYC1t（Addgene，目录号：43802）
大肠杆菌DH5α感受态细胞（NIPPON GENE，目录号：316-06233）
DNA，来自鱼类精子的MB级（Roche Diagnostics，目录号：11467140001）
KOD plus neo（TOYOBO，目录号：KOD-401）
2mM dNTP溶液（加入KOD加neo）
25mM硫酸镁（MgSO 4）（附在KOD plus neo中）
用于构建表达gRNA的质粒（5'-N20GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'）（在Sigma-Aldrich Japan中合成）的寡核苷酸引物1）
用于构建表达gRNA的质粒（5'-cN20GATCATTTATCTTTCACTGCGGA-3'）的寡核苷酸引物2（在Sigma-Aldrich Japan中合成）
Ip（Takara Bio，目录号：1235A）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
10x NEB缓冲液2（New England Biolabs，目录号：B7002S）
BSA溶液（连接在T4 DNA聚合酶中）（New England Biolabs，目录号：M0203）
10x T4 DNA连接酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0202）
T4 DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0203）
2.5mM各dNTP混合物（Takara Bio，目录号：4030）
氨苄青霉素（和光纯药工业公司，目录号：015-10382）
用于构建分裂模块的寡核苷酸引物1（5'-N 50 GGCCGCCAGCTGAAGCTTCG-3'）（在Sigma-Aldrich Japan中合成）
用于构建分裂模块的寡核苷酸引物2（5'-CCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAAAGGCCACTAGTGGATCTGAT-3'）（在Sigma-Aldrich Japan中合成）
用于测序的寡核苷酸引物（5'-ACGCCAAGCGCGCAATTAAC-3'）（在Sigma-Aldrich Japan中合成）
乙酸锂二水合物（Wako Pure Chemical Industries，目录号：120-01535）
聚乙二醇4000（Wako Pure Chemical Industries，目录号：162-09115）
ECL直接核酸标记和检测系统（GE Healthcare，目录号：RPN3000）
溴化乙啶溶液（10mg/ml）（Nacalai Tesque，目录号：14631-94）
LB肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3022-1KG）
琼脂（Wako Pure Chemical Industries，目录号：010-08725）
葡萄糖（和光纯药，目录号：043-31163）
不含氨基酸的酵母氮碱（例如，BD，Difco，目录号：291940）
氢氧化钠（NaOH）（例如和光纯药工业公司，目录号：192-15985）
蛋白胨（例如，BD，Bacto ^{TM，目录号：211677）}
酵母提取物（例如，BD，Bacto ^{TM，目录号：288620）}
盐酸（HCl）（例如和光纯药，目录号：087-10361）
LB板（参见食谱）
酵母最低培养基（SD培养基）（见食谱）
YPD培养基（见食谱）

设备

移液器
热循环仪（例如，，Takara Bio，型号：Dice Touch ，目录号：TP350）（在程序B和程序C中使用）
孵化器（例如，松下医疗保健，型号：MIR-H163）（在程序B和程序D中使用）
空气振荡器（例如，TAITEC，型号：BR-21UM MR）（在程序B和程序D中使用）
热块（例如，TAITEC，型号：DTU-1BN）（在程序B中使用，程序D和程序E）
DNA测序仪（例如，应用生物系统公司，Applied Biosystems，型号：ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer）（在步骤B中使用）
CHEF-DR ^{®III脉冲场凝胶电泳系统（Bio-Rad Laboratories，型号：CHEF-DR III冷却器系统，目录号：1703700）}

程序

设计gRNA靶位点
一旦您决定要分裂的基因组位点，搜索目标基因座附近的Cas9切割（5'-NGG-3'或5'-CCN-3'）的PAM序列。确定最合适的20 bp指导RNA（gRNA）靶序列，使得gRNA靶序列不存在于DNA分裂模块中（参见方法C），并且不预测gRNA靶序列诱导任何脱靶裂解。 CRISPRdirect（ https://crispr.dbcls.jp/）可能有助于设计目标序列。将您的目标序列粘贴到框中，然后选择。啤酒酵母S288C基因组进行特异性检测。那么你可以很容易地知道最适合的RNA靶序列。已知CRISRP/Cas9系统的切割点是PAM序列上游3 bp（Jinek等人，2012）。希望将分割点设计在与CRISPR/Cas9切割的同一点上。但是，除非分裂模块不包含gRNA靶位点，否则这不是绝对要求。
用设计的20bp靶序列构建表达gRNA的质粒
我们使用p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t作为模板质粒，通过PCR构建所需的表达gRNA的质粒。您可以使用任何质粒来表达您想要的gRNA。以下协议是使用p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t作为模板质粒的版本。质粒构建的原理是基于SLIC技术（Li和Elledge，2012）。
1. 转化大肠杆菌
  变换E。通过引入2μl来自步骤B6的溶液的DH5α菌株。在37℃下孵育1小时后，铺在含有氨苄青霉素的LB平板上。
2. 通过测序分析确认质粒构建
  注意：虽然大多数大肠杆菌转化体含有所需的gRNA质粒，但最好使用引物5'-ACGCCAAGCGCGCAATTAAC-3'进行测序分析来检查。
构建具有50bp同源序列的分裂模块
1. 在确定在步骤A分裂点后，设计和购买寡核苷酸引物以扩增任何遗传标记基因，其侧翼具有对应于两个引物的靶分裂点上游和下游的50bp同源性序列（参见图2）。对于PCR模板，我们使用基于pUG6的质粒组（Guldener等人，1996），用于PCR扩增，但是使用不同的遗传标记基因（ Candida glabrata LEU2 基因，假丝酵母HIS3基因，URA3和KanMX ）或着丝粒（CEN4 ）（Sugiyama等人 >。，2005）。选择合适的质粒作为PCR的模板，使新生成的染色体含有一个着丝粒。这些质粒可用于NBRP（ http ：//yeast.lab.nig.ac.jp/nig.v2.1/index.html ）。
  
  图2.分割模块构建的详细说明有五个模板质粒构建分裂模块。 CEN4 是S染色体IV的着丝粒序列。酵母。由于所有模板质粒都具有相同的质粒骨架（pUG6质粒），所以质粒的所有序列除遗传标记基因之外都是相同的。因此，当您使用任何质粒作为模板时，退火到模板质粒所需的引物序列很常见。在寡核苷酸引物1和2中，除了退火序列之外，还应分别添加与染色体中目标分裂点的上游和下游序列相同的50bp序列。闭合的黑色圆圈代表着丝粒。红色和蓝色框分别表示染色体中目标分裂点上游和下游的50bp序列。箭头代表端粒序列。
2. PCR反应
  
  PCR反应后，通过QIAquick Gel Extraction Kit凝胶提取纯化PCR产物将纯化的分离模块DNA溶解于50μl洗脱缓冲液中
转型
1. 通过引入p414-TEF1p-Cas9-CYC1t，预先制备酵母菌株，其组成型表达密码子优化的Cas9用于酵母表达。
  注意：可以进行许多营养缺陷型标记选择的酵母菌株是可取的。我们使用FY834菌株（MATαura3-52his3Δ200leu2Δ1lys2Δ202trp1Δ63）。通过LiAc/PEG法引入p414-TEF1p-Cas9-CYC1t质粒来转化FY834菌株。因为p414-TEF1p-Cas9-CYC1t质粒具有TRP1标记，所以可以在不含色氨酸的培养基中生长的转化体。
2. 在液体酵母最低培养基（需要氨基酸和核酸碱补充的SD培养基）中培养菌株过夜。
3. 用酵母细胞预培养物接种新鲜的50ml YPD培养基，以获得约0.2-0.3的初始OD 600。然后在30℃下以140rpm的振荡速度孵育，直到OD 600达到0.8-1.0（约4至6小时）。
4. 将分离的DNA模块（各自为1-5μg）和表达gRNA的质粒（各7.5μg）混合，并通过常规的LiAc/PEG方法进行转化（Gietz和Schiestl，2007）。 LiAc/PEG方法使用鲑鱼精子DNA乙酸钙，乙酸锂和聚乙二醇4000（在材料和试剂部分列出）。
  注意：在我们的方案中，当表达gRNA的质粒的量为7.5μg时，达到最大的转化效率。然而，即使使用较少的表达gRNA的质粒（例如1μg），也可以获得多个分裂转化体。
5. 转化后，将细胞悬浮于200μl灭菌水中，并铺在适当的选择板上，并在30℃下孵育2或3天。
  注意：通过gRNA表达质粒上的遗传标记基因选择转化体是不必要的并且可能降低转化效率。通常导致转化体数量减少，这可能是由于持续的目标Cas9-核酸内切酶活性
通过脉冲场凝胶电泳和随后的Southern印迹确认分裂事件
1. 根据试剂盒协议（例如，CHEF Genomic DNA Plug Kits使用手册，Bio-Rad Laboratories）准备插头。
2. 用适当的装置（例如Bio-Rad Laboratories的CHEF系统）进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）。在Sugiyama等人，2005中描述了PFGE的典型设置。
3. 电泳后，用溴化乙锭溶液（1μg/ml）对凝胶进行染色以检查转化体的核型。
4. 通过常规的印迹法进行膜印迹（Southern，2006）
5. 通过适当的DNA标记试剂盒（例如ECL直接核酸标记和检测系统）准备探针以检测特定区域，并进行探针杂交。
  注意：探针是具有特异性序列的标记单链DNA，以检测与探针具有相同序列的DNA分子的存在。通常，探针的大小为500bp至1,000bp。虽然目标染色体中的任何区域都可以用作检测分离事件的探针，但您可以选择在分割点上延伸的区域。当您使用这样的探针时，将出现与分裂事件产生的两条染色体相对应的两条带。另一方面，如果没有发生分裂事件，则仅出现对应于完整染色体的一个条带。典型的结果如图3所示。
6. 根据您使用的DNA标签试剂盒手册检测标记的探针。
  
  图3. CRISPR-PCS染色体分裂的典型结果。 IV由CRISPR-PCS在位置999,122.5处分裂。探针被设计为延伸到分裂点（从998,717到999,302）。野生型菌株（称为WT）显示对应于完整Chr的单条带。 IV，而转化体（指定为1,2和3）显示两条带，表明Chr。 IV在目标点分裂。

数据分析

每个实验中转化体的数量不同。通常，当仅靶向一个基因组位点时，可以获得数百个或更多的转化体，并且几乎所有转化体都具有预期的分裂。即使定位多个网站，也可以获得数百个转化体，尽管预期分裂的转化体的频率降低。对转化体的检查应产生10个转化体中至少一个正确分裂的转化体。

食谱

LB板
2％LB肉汤（Sigma-Aldrich）
1.5％琼脂

酵母最低培养基（SD培养基）
2％葡萄糖
0.67％不含氨基酸的酵母氮碱（例如，BD Difco）
注意：如果需要，可以使用含有用于营养缺陷选择的缺乏合适氨基酸的所有氨基酸的混合物。
用NaOH调节至pH = 6.0 对于平板培养基，添加2％琼脂

YPD媒体
2％葡萄糖
2％蛋白胨（例如，BD Bacto TM ）
1％酵母提取物（例如，BD Bacto TM）/
用HCl调节至pH = 6.0

致谢

这项工作得到科学研究资助（B）[15H04475]（SH），"挑战性探索性研究补助金"[26660066]（至SH）和青年科学家助学金的支持（B）[15K18672]（来自YS）来自日本的教育，文化，体育和科技部（MEXT）。

参考

Agmon，N.，Pur，S.，Liefshitz，B.and Kupiec，M。（2009）。同源重组期间修复机制选择的分析。 Nucleic Acids Res 37（15）：5081-5092。

Gietz，RD和Schiestl，RH（2007）。高使用LiAc/SS载体DNA/PEG方法的酵母菌转化效率。 Nat Protoc 2（1）：31-34。

Guldener，U.，Heck，S.，Fielder，T.，Beinhauer，J.and Hegemann，JH（1996）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm .nih.gov/pubmed/8692690"target ="_ blank">一种用于萌芽酵母重复使用的新型有效的基因破坏盒。核酸研究24（13）：2519-2524 。

Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，JA和Charpentier，E.（2012）。可编程双RNA引导的DNA内切核酸酶在适应性细菌免疫中的应用。科学 337（6096）：816-821。

Li，MZ and Elledge，SJ（2012）。 SLIC ：用于顺序和连接非依赖性克隆的方法。 Methods Mol Biol 852：51-59。

Southern，E.（2006）。 Southern印迹。 Nat Protoc 1：518-525。

Sugiyama，M.，Ikushima，S.，Nakazawa，T.，Kaneko，Y.and Harashima，S。（2005）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/16018552"target ="_ blank"> PCR介导的酿酒酵母重复染色体分裂。 38（6）： 909-914。