材料和试剂

96孔板，平底（SARSTEDT，目录号：82.1581）
移液器提示
由noxes（例如，氧和葡萄糖剥夺，谷氨酸或其他毒素）处理的神经元细胞培养物（Koh和Choi，1987; Bruer等人，1997; Harms等人，2001; Ruscher等人，2002; Harms等人，2004; Meisel等人[ ，2006; Harms等人，2007; Datwyler等人，2011; Schweizer等人，2015; Donath em>等，，2016）
注意：该协议适用于源于大脑各个区域的主要神经元培养物，包括隔膜，海马，纹状体，脊髓，皮质，小脑或裂核，并以各种密度或各种培养基制剂或板的涂层。然而，我们通过体外培养超过7天的培养物（DIV）获得最佳结果，并以如下所示的合理密度接种（图1和图2）。这些培养物含有约10％的神经胶质细胞，这不会影响分析上清液中LDH释放的可能性。

图1.来自小鼠E15胚胎的原代皮层神经元培养物在体外7天后（DIV）。比例尺=50μm。

图2.在DIV 8上用50μM谷氨酸盐处理24小时的原代皮层神经元培养物。比例尺=50μm。
Triton X-100溶液（Sigma-Aldrich，目录号：93443）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（MW 136.1）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
磷酸二氢钾（K 2/2 HPO 4 MW; MW 174.2）或磷酸三钾水合物（K 2 HPO 4） 3H 2 O; MW 228.2）（Sigma-Aldrich目录号：P5504）
蒸馏水
丙酮酸钠（MW110）（Sigma-Aldrich，目录号：P2256）
LDH标准（TruCal U）（DiaDys Diagnostic Systems，目录号：5 9100 99 10 063）
-NADH（MW 709.4，还原形式）（Sigma-Aldrich，目录号：N8129）
10x LDH缓冲液（见配方）
1x LDH缓冲（见配方）
LDH标准（见配方）
丙酮酸钠溶液（参见食谱）
-NADH-溶液（参见食谱）

设备

移液器
CO 2 - 细胞培养物的培养基
多吸管（Eppendorf，型号：Multipette ^{® plus）}
用于96孔板的分光光度计，其可以测量340nm并进行动力学测量（例如，Dynex Technologies，型号：MRX Microplate Reader）

程序

解决方案的准备（见配方）
测量
1. 加热NADH和适量的丙酮酸钠溶液（对于一个96孔板，您需要约2.5毫升的丙酮酸钠溶液）至室温或最大。 37℃，解冻适量的LDH标准等分试样。
2. 移取每孔50μl细胞培养液（探针）。推荐每个细胞培养物的重复测量。
3. 在每个板2个孔中吸取25μlLDH标准液。在每个96孔板上执行标准测量非常重要。
4. 向每个孔中加入200μlNADH溶液，并在必要时清除气泡。测定中NADH的最终浓度为153.8μM
5. 向每个孔中加入25μl的丙酮酸钠溶液。酶反应迅速开始。测定中的丙酮酸钠的最终浓度为2.063mM。不要将样品与移液管混合。应通过在每个测量周期之前和之间的平板阅读器自动振荡来启动混合。如果过量的NADH可用于酶反应，则反应在线性范围内。这持续约7-10分钟。理想情况下，丙酮酸的吸取和所有循环的测量应在此期间完成。不要一次在多于一个的板上开始反应。可能需要稀释样品，如图3所示
  
  图3.测量的代表性图。蓝线表示未稀释，红线表示稀释（F1：4，红色）运动曲线。请注意，未稀释的样品在340 nm处显示吸收的非线性降低。
6. 立即用以下参数开始吸收测量：
  1. 波长：340 nm
  2. 测量周期：10.
  3. 周期时间：30秒。
  4. 震动时间：5秒
  5. 温度：37°C（另见注）。
总溶解
1. 在细胞培养基的其余部分添加Triton X-100，最终浓度应为0.5％
2. 在37℃下孵育20分钟。可以孵育更长时间直到4-6小时或过夜。只要你平等对待所有团体，这并不重要
3. 重复第2段（测量）中的步骤2b-2f。

数据分析

计算每个孔的吸收减少量，单位为mAbs / min。在我们手中，值约为10-50 mAbs / min。
注意：检查，如果吸收的减少在整个时间内是线性的。否则减小探头的体积或稀释。
LDH标准吸收的降低等于LDH活性约为500 U / L。标准中的LDH活动在不同批次中有所不同。根据制造商规格计算。
使用比例规则计算探针的LDH活性。
示例：
1. 探头吸收减少：15 mAbs / min。
2. LDH标准吸收减少：43 mAbs / min
3. LDH活性标准为466 U / l。
方程式：（15 mAbs / min x 466 U / l / 43 U / l）= 162.5 U / l
根据探头体积和LDH标准体积的关系调整探针的LDH活性。
最后，在总LDH释放（“完全杀死”）后评估LDH活性后，计算LDH活性在同一细胞培养物样品中LDH活性的百分比。

笔记

反应速率取决于温度。如果您的探针具有较高的LDH活性，并且额外的高温可能会导致-NADH的耗尽，并导致吸收的非线性降低。
细胞裂解后的总LDH释放量（“完全杀死”）的评估推荐用于每种细胞培养。有一些治疗方法，导致细胞中蛋白质合成的增加，使得细胞中总LDH的量也增加。在这种情况下，归一化有助于更好地作为间接测量细胞死亡的相关性
如果样品被密封，可以将样品的上清液储存在4℃，以避免蒸发2至3天，同时LDH活性降低最小。不要冻结样品。

食谱

10x LDH缓冲区
45.3g KH 2 PO 4
116.1g K 2 HPO 4或152g K 2 HPO 4·3H 2 O
溶解在约800毫升蒸馏水中，调节pH至7.4，并用蒸馏水填充至1000毫升存储在4°C，解决方案稳定12个月
1x LDH缓冲区
用蒸馏水稀释10倍LDH缓冲液1:10
存储在4°C，长期存储长达12个月可能
LDH标准
根据制造方案溶解酶的裂解物，制备105μl的等分试样（用于测量两个板）并储存在-20℃。避免冻融循环
丙酮酸钠溶液
将1.25 g的丙酮酸钠溶解于500 ml 1x LDH缓冲液中，得到22.7 mM的丙酮酸钠溶液，储存于4°C。该解决方案稳定18个月
-NADH解决方案
将3毫克-NADH溶于20毫升1x LDH缓冲液中，得到211.4微克溶液注意：20毫升是一个96孔板的量。该解决方案仅在4°C下稳定2天。

致谢

这项工作由德国研究基金会（SFB TRR43和HA5741 / 1-2至Christoph Harms），联邦教育和研究部（01 EO 08 01）支持，为柏林中风研究中心提供资金（项目“SUMO和克里斯托弗·哈姆斯（Christoph Harms），柏林健康研究所TRG7，TP1，Christoph Harms。

参考

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