材料和试剂

18 G针
3 x 3 in。中等纱布垫（CVS，目录号：893120）
C57BL / 6J雄性小鼠（抵达6-7周）（JACKSON LABORATORY，目录号：000664）
水族馆密封胶
（二（2,2,2-三氟乙基）醚或2,2,2-三氟乙基醚）（Sigma-Aldrich，目录号：287571）
重要事项：在化学通风柜中进行所有氟烷基曝光，排除实验室外的废气，因为吸入氟乙烯将导致人体缉获。
95％乙醇（乙醇190证明）（PHARMCO-AAPER，目录号：111000190）
石油果冻
10％氟乙基溶液（见配方）

设备

全透明真空有机玻璃干燥器室（Ted Pella，型号：2240-1）
20毫升玻璃注射器（Sigma-Aldrich，目录号：Z101079）
注射泵（Kent Scientific，型号：GENIE Plus）
镊子（用于从室中除去氟乙烯饱和纱布垫）
具有至少1/4“方形网格的网状漏勺
化学通风柜

程序

氟乙烯室的构造
1. 有机玻璃室需要在室顶部钻出一个小孔，以便将18 G针固定在该孔中（18 G针在针的塑料边缘的鲁尔锁定端处切割，针的斜边缘产生短的18G钝钢管）。 18G针管在将其固定到腔室的顶部时连接到腔室外部的小直径管道。此时，用水族密封剂密封与管道和腔室的顶部的连接，以确保腔室是气密的。 18 G管的无管端应该延伸到腔室的顶部。另外，请务必用水族箱密封剂（这通常是真空阀附着的地方）密封上半部分的其他开口。
2. 接下来，将屏幕支撑带固定在18 G针管悬挂下方的纱布垫上。室内的顶部和底部应经常用油膏润滑，以确保腔室的顶部，底部和O形环之间的充分密封。管的另一端连接到连接到注射泵的20ml玻璃注射器（图1）。
  
  图1.重复的氟乙烯吸收模型设置。黑色箭头指向从注射器的松弛管道到腔室顶部的18 G钢管。
重复荧光素检测模型
1. 允许小鼠随意获取食物和水，并保持在标准的12小时黑暗周期，上午7:00点亮。在癫痫发作测试前，允许小鼠适应动物设施约1周。将单个小鼠（7-8周龄）暴露于10％氟乙基（参见食谱部分）。氟化乙基在封闭的有机玻璃室中输送给小鼠。氟乙基在GABA A A受体上结合，其中它作为非竞争性拮抗剂（Krasowski，2000）。由于受非竞争性拮抗剂结合的受体不会通过激动剂的结合而被活化，并且由于乙醇是GABA A A受体的正变构调节剂，所以乙醇不太可能在在氟乙基存在下的GABA A A受体。
2. 确保在认证的化学通风橱中进行所有氟烷基曝光，并排出实验室，因为吸入氟乙基会导致人体癫痫发作。
3. 通过注射泵和玻璃注射器，以6ml / h的流速将10％的氟乙基通过筛网（图1）输入到从室顶部悬浮的纱布垫（折叠成两半）。由于氟乙基具有高挥发性，因此其迅速蒸发，导致吸入和随后的发作表达。广义发作阈值（GST）定义为从氟氯乙烯注入开始到发生动物失去姿势控制的潜伏期。
4. 一旦动物失去其姿势（即，，表示广泛的阵挛性发作;等级1-2 [参见表1]），将该腔室打开至新鲜空气，导致快速消除氟乙基（氟氯乙酸输液泵关闭）。具有不同遗传背景的小鼠将以不同的延迟对姿势控制的丧失作出反应（即，，GST）。在不同的小鼠品系中，试验1 GST可以在200-500秒的范围内（Papandrea等人，2009）。然而，鉴于这是行为分析，菌株内的变异性相当小。当顶部被移除时，将丝网滤网放置在腔室的底部是很好的做法，以防止鼠标从腔室中跳出。这在28天的氟乙基孵育期和氟乙基重新触发之后尤为重要，因为小鼠经常会发生脑干癫痫发作，这可导致小鼠具有野蛮的运动和弹跳癫痫发作，其中它们可以从腔室的下半部分逸出。丝网滤网有助于将鼠标放在腔室的下半部分，同时还将动物暴露于室内空气。
5. 第一个肌阵挛跳动的延迟（行为上，肌阵挛的冲动是短暂的，但重要的是颈部和身体肌肉组织的收缩，同时保持姿势控制[Applegate等人，1997年; Samoriski和Applegate，1997年]），在广泛性癫痫发作发作之前表达的肌阵挛爆发的数量，姿势控制丧失的延迟（GST），恢复姿势的时间，癫痫发作的持续时间（以从全身癫痫发作到动物恢复其姿势并停止显示四肢的克隆），并且每次试验记录癫痫发作的类型（表1）。
  
  表1.行为癫痫发作分级评分量表
  < *一般来说，1级和2级是克隆前脑癫痫发作，相当于Racine电烙术的5级癫痫发作（Racine，1972年）。 3-7年级脑干癫痫发作。重要的是，小鼠恢复正常反射，然后转为3-7年级（Kreindler等，1958; Browning和Nelson，1986）。我们将具有3-7级癫痫发作的小鼠归类为前脑脑干癫痫发作，以表示这种癫痫发作的进展。
6. 缉拿后，将动物送回家中笼，直到第二天。每次使用新的纱布垫，在氟乙烯室中一次测试一只鼠标。每天给予10％氟乙基引起的癫痫发作8天（荧光素诱导期），随后4周休息期（氟乙烯潜伏期）。我们经常尝试将诱导试验之间的时间间隔尽可能接近24小时（24±4 h）。以前的工作已经证明了8次诱导试验的必要性和观察到的效果的28天潜伏期（Samoriski和Applegate，1997）。氟化乙烯饱和的纱布垫，使用镊子从筛子上取下室的上半部分，以免用氟乙烯污染手套。纱布垫布置在通风柜下面，以使氟乙烯蒸发。第二天纱布垫可以再次使用，因为这个时候氟乙烯将完全从纱布上蒸发出来。
7. 在28天的潜伏期后，再次给予小鼠氟尿素暴露（重新测试/重新触发），并记录上述标准。来自C57BL6 / J小鼠的代表性例子显示了对第一次肌阵挛反应的延迟观察到的变化，肌阵挛性跳动的数量和广泛发作的癫痫发作阈值（图2）。 C57BL6 / J小鼠通常在8次氟化诱导试验期间不表达前脑脑干癫痫发作，但是在28天的潜伏期和氟乙基复苏中，相当一部分的小鼠现在表现出这种新的癫痫发作行为（图3）。 >
  
  图2.肌力振幅阈值，肌阵挛跳数，以及C57BL6 / J小鼠中的广泛发作阈值（GST）。第一次肌阵挛反应的潜伏期（肌阵挛刺激阈值（以秒为单位）），在全身癫痫发作发生之前表达的肌阵挛反应的数量，以及C57BL6 / J小鼠每次癫痫发作的广泛性癫痫发作（广泛性发作阈值）的潜伏期。再次测试是在28天潜伏期后对氟乙的重新测试。
  
  图3.在8次诱导期癫痫发作期间C57BL6 / J小鼠中的氟乙基引起的发作行为，以及28天孵育阶段后的最终氟乙基重新振荡（重新测试）。虽然没有一个C57BL6 / J小鼠在氟烷基诱导试验（这些小鼠只表达阵挛前脑癫痫发作）期间，表达复杂的前脑→脑干癫痫发作，75-100％的C57BL6 / J小鼠将在28天的潜伏期内对氟乙烯进行再刺激后表达前脑→脑干癫痫发作。
8. 另外，在28天的培养期间，来自C57BL6 / J小鼠的大脑皮层和海马的局部场电位记录显示，氟乙基暴露的小鼠在第8次氟乙基诱导试验后发生自发性发作，相对较高的发作发生（Kadiyala等人，2016）。然而，这些癫痫发作开始于28天的孵化阶段（Kadiyala等人，2016）。有趣的是，类似治疗的DBA / 2J小鼠也发生了比C57BL6 / J小鼠更少的发作发作的自发性发作，但DBA / 2J小鼠中观察到的自发性发作似乎不显示（Kadiyala和Ferland，2017）。