材料和试剂

27 G x 5/8注射器（BD，目录号：329412）
0.5μm膜过滤器（EMD Millipore，目录号：FHLC04700）
6-8周龄的雌性NU / J裸鼠（THE JACKSON LABORATORY，目录号：007850）或CB17严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠（Charles River，Quebec，Canada）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），无菌（Corning，目录号：21-040）
丁丙诺啡SR-LAB（Zoopharm，Windsor，CO）
Betadine
70％酒精
眼科软膏
0.9％氯化钠灌洗（Hospira，目录号：0409-6138-22）
2,2,2-三溴乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：T48402）
2-甲基-2-丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：152463）
Avertin工作溶液或氯胺酮/赛拉嗪/ acepromazine（参见食谱）

设备

镊子（使用前灭菌）（精细科学工具，目录号：11006-12）
手术剪刀（使用前灭菌）（精细科学工具，目录号：91402-12）
反射伤口闭合夹子（精细科学工具，目录号：12020-09）
反射伤口闭合夹（精细科学工具，目录号：12022-09）
反射伤口夹去除器（精细科学工具，目录号：12023-00）
加热灯（Morganville Scientific，目录号：HL0100）
BETADINE ^{® Solution Swab Aid ^{®防腐垫（Moore medical，目录号：90697）}}
消毒剂清洁剂（Sigma-Aldrich，目录号：Z692158）
修剪器/剪刀（Wahl Clipper，目录号：8685）

程序

高压灭菌镊子，手术剪刀，伤口闭合敷贴器和手术前的夹子。
整个外科手术应在无菌罩下进行
在小鼠之间使用Virkon ^{®消毒剂清洁剂清洁手术设备。}
胰蛋白酶消化80％汇合的结肠直肠癌细胞，例如HT-29和HCT116，并用PBS洗涤细胞，在4℃下以200×g离心5分钟。弃上清，重复洗涤步骤三次。
在冰上保存细胞（5×10 ^{6 -1 x 10 ^{7 细胞），并在注射前检查细胞活力。实施例：对于10次注射，在12×50μlPBS中制备至少12×5×10 6个至12×1×10 7个细胞。}}
术前10分钟施用丁丙诺啡（0.1 mg / kg，皮下注射）。
用Avertin溶液（0.5ml / 25mg小鼠）或氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪（0.2ml / 20mg小鼠）腹膜内注射小鼠，在手术前麻醉小鼠。
通过捏脚检查后肢反射，以确保小鼠睡着了。感应时间约1-2分钟。如果使用Avertin，手术麻醉持续约15-45分钟，睡眠时间为60-120分钟。
注意：如果使用氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪，手术麻醉持续约30-40分钟，睡眠时间为60-180分钟。
动物的制备：1）通过使用修剪器/剪刀从手术区域去除头发（如果使用SCID小鼠） 2）从外科切口开始以旋转方式施用betadine，向外旋转; 3）替代甜菜碱与70％酒精; 4）重复三次，每次使用后丢弃棉垫; 5）手术前应用双眼眼药膏以防止干涩; 6）开始前，用无菌悬垂覆盖啮齿动物，避免切口污染; 7）在手术过程中，使用热垫保持体温正常。
将动物置于腹侧卧位。通过一对镊子和手术剪刀，沿着生殖器前方约1厘米的下腹部做一个0.5英寸长的中线皮肤切口。然后将体壁切开相同的长度。从切口轻轻拉出盲肠和升肠。在整个手术过程中，保持暴露的盲肠和上升的结肠潮湿0.9％氯化钠
将50μlPBS中的5×10 6个结肠癌细胞注入盲肠壁（图1）。（Tseng等人，2007）
注意：确保从细胞悬浮液中除去气泡。

图1.小鼠胃肠道示意图盲肠和注射部位如图所示。
将盲肠和上结肠放回腹腔。
注意：注意不要挤压注射区域。
缝合腹肌层，然后用伤口夹紧肌肤。
保持老鼠在加热灯下温暖，直到小鼠从麻醉中恢复。灯泡应保持距离鼠标12-14英寸，应进行细心监控以防止过热。手术加热垫或温控笼/培养箱可作为替代品使用。监护小鼠，直至保持直立姿势，并在返回动物房间前正常行走。
根据需要，术后给予丁丙诺啡（0.1 mg / kg，一次72 h注射后皮下注射）。
手术后每天检查小鼠感染或疼痛迹象。如果发生感染，可以使用抗生素。
7-10天后，一旦切口愈合，请用伤口夹去除器取下夹子。

数据分析

手术后一个月，可以收获肿瘤以测量肿瘤重量和肿瘤体积。然而，肿瘤生长速度和肿瘤体积取决于注射的细胞系。肿瘤直径用数字卡尺测量，肿瘤体积（mm ^{3 ）通过下列公式计算：体积=（宽度）^{2 x长度/ 2。切除后可通过Ki67 /苏木精的免疫组织化学染色进一步证实肿瘤。另外，取决于设备和试剂的可用性，小动物成像仪器，包括X射线计算机断层扫描（CT），磁共振成像（MRI）或生物发光成像，是非侵入性测量异种移植肿瘤负担的有用工具。可以通过生物发光成像（如果细胞含有荧光素酶）或通过在注射后16周内Ki67 /苏木精染色后的显微镜分析进一步检查淋巴结，肝和肺转移。每组至少要推荐5只小鼠。 A 值< 0.05被认为是显着的使用学生的测试。然而，使用的小鼠数量取决于所测试的假设和统计测试。功率分析应在实验开始之前进行。}}

笔记

在细胞进行胰蛋白酶消化后，尽快完成注射。理想情况下，细胞应在胰蛋白酶消化后1小时内注射。
结肠癌细胞容易聚集。在计算注射细胞数时，确保细胞完全分离，以减少不同老鼠之间的差异
Avertin溶液黄化表明毒性降解。当黄色变为黄色时，放弃解决方案。
NIH和欧洲指南不鼓励使用Avertin。 Avertin的使用必须由机构动物护理和使用委员会（IACUC）证明和批准。或者，氯胺酮/赛拉嗪/ acepromazine鸡尾酒是另一种常用的可注射麻醉剂。

食谱

Avertin工作解决方案
1. 将2.5g三溴乙醇溶于5ml 2-甲基-2-丁醇中。加热至约40°C，并在黑暗中剧烈搅拌
2. 加入蒸馏水至终体积200毫升，在黑暗中连续搅拌直至固体溶解
3. 通过0.5μm膜过滤器过滤溶液
4. 将过滤的溶液在4℃的黑暗中储存。 2周后丢弃未使用的溶液
氯胺酮/赛拉嗪/ acepromazine鸡尾酒
1. 混合1ml氯胺酮（100mg / ml），0.5ml甲苯噻嗪（20mg / ml）和0.3ml乙酰丙嗪（10mg / ml），然后加入8.2ml生理盐水（0.9％）或PBS
2. 将无菌溶液保存在无菌容器中
注意：
2. 在手术或加入乙酰丙嗪之前，氯胺酮/赛拉嗪与NSAID联合将增加氯胺酮/赛拉嗪的麻醉效果。

致谢

这项工作得到NIH（CCSG CA16672）的支持。德州癌症防治研究所（RP150245）;德克萨斯大学MD安德森中国医科大学和医院姐妹机构基金会;科技部，台湾国际研究密集型中心（I-RiCE; MOST 105-2911-I002-302）;中国医科大学附属医院癌症研究中心生福利部（MOHW106-TDU-B-2 12-144003）。该协议改编自 Journal of Clinical Investigation （Liao等人，2015）之前的工作。

参考

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摘要：目的：研究iao，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，， Lee，HH，Tai，SK，Yang，MH，Morelli，MP，Sen，M.，Ladbury，JE，Chen，CH，Grandis，JR，Kopetz，S.and Hung，MC（2015） =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26571401”target =“_ blank”> EGF受体的PRMT1介导的甲基化调节信号传导和西妥昔单抗应答。 > J Clin Invest 125（12）：4529-4543。

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