材料和试剂

0.2-10μl移液器吸头，Corning ^{® Isotip ^{®过滤（Corning，目录号：4807）}}
1-200μl移液器吸头（Corning，Axyge ^{®，目录号：TF-200-R-S）}
100-1,000μl移液器吸头（Corning，Axygen ^{®，目录号：TF-1000-R-S）}
1.5ml微量离心管（RNase，DNase和无热原）（Corning，Axygen，目录号：MCT-150-C）
0.2ml薄壁PCR管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：3412）}
Falcon ^{®将50ml锥形离心管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352070）}}
pSuper基本载体（Oligoengine，目录号：VEC-pBS-0002）
miRNA编码寡核苷酸（PAGE纯化）5'-pGATCTAGCACGACTCGCAGCTCCCAAGAGCCTAACCCGTGGATTTAAACGGTAAACATCACAAGTTAGGGTCTCAGGGACTGAGAGGAGCGCAA-3'
用于最小H1（mH1）启动子的寡核苷酸（PAGE纯化）
mH1-Fw：5'-pAATTCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGAGCACAGA-3'
mH1-Rv：5'-pGATCTCTGTGCTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCCAAATCCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGATTTCCCAGAACACATAGCGACATGCAAATATG-3'
UltraPure ^{TM DNase / RNase-Free蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10977015）}}
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670-100G）
dNTP设置100mM溶液（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：R0181）}
用于mH1启动子扩增的寡核苷酸引物（HPCL纯化）
NbBpu-Fw
5'-pTTAGGAGTTTTCTCCTAAGCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTG-3'
BamHI-Rv
5'-TGCAGGATCCCTGTGCTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC-3'
DNA聚合酶，重组体（5U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：EP0402）}
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28106）
10x FD缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：B64）}
Nb.Bpu10I（5U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：ER1681）}
FastDigest Bam（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：FD0054）}
shRNA编码寡核苷酸（PAGE纯化）5'-pGATCTAAAAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTCTCTTGAAGGCTCCTCAGAAACAGCTCTTTTTA-3'
T4 DNA连接酶（5U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：EL0014）}
中和寡核苷酸（HPLC纯化）
5'-TTAGGAGTTTTCTCCTAA-3'
腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：A2383-1G）
FastDigest II（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：FD0083）}
T7 DNA聚合酶（10U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：EP0081）}
苯酚溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4557-100ML）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：288306-1L）
3-甲基-1-丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：309435-100ML）
乙醇，绝对（Fisher Scientific，目录号：BP28184）
3M醋酸钾（pH 4.8）
乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2889-250G）
FastDigest RI（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：FD0274）}
琼脂糖，LE，分析纯（Promega，目录号：V3125）
溴化乙锭溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610433）
GeneRuler DNA梯形混合物（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：SM0331）}
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888-500G）
Tris-HCl（Powder）（Roche Diagnostics，目录号：10812846001）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS-100G）
10x杂交缓冲液（参见食谱）
TE缓冲（见配方）

设备

移液器（Gilson，PIPETMAN ^{®经典型号：P2，P20N，P200N和P1000N）}
标准热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，型号：GeneAmp PCR System 9700）
注意：本产品已停产。}
Gel doc（Bio-Rad Gel Doc Imager）
凝胶运行装置（Thermo Fisher Scientific，Amersham Biosciences ^{TM ）}
凝胶染色托盘
台式离心机（Eppendorf，型号：5430 R）
热块（Eppendorf，型号：Thermomixer ^®舒适）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：NanoDrop 2000）}
玻璃烧杯（Schott，Duran）
微波（松下）

软件

ImageJ（ http://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

在本协议中，我们描述了a）shRNA（例如db-iPRT-hp-s / as：靶向荧光素酶）或b）miRNA（例如db-hp-miR-125b-1：表达has-miR- 125b-1）表达最小化的哑铃载体（Jiang等人，2016）。对于这些哑铃，shRNA或miRNA表达由人类最小H1（mH1）启动子驱动。使用引入用于切口内切核酸酶的切割位点的正向引物和引入常规限制性内切核酸酶切割位点的反向引物对mH1启动子进行PCR扩增。在PCR产物与内切核酸酶两者孵育后，通过切口反应产生的重折叠突出形成哑铃的一个环结构，而另一个环通过连接shRNA或miRNA编码的发夹寡脱氧核糖核苷酸形成。在适当的限制酶存在下进行连接，以抑制产生不必要的产物（Cost，2007）。通过核酸酶（ELAN）方法辅助的酶促连接抑制了在限制性内切核酸酶存在下被切割的环寡聚体或表达盒组成的失调产物如二聚体的形成（在该实施例中， HI和Bgl II），从而有助于形成不包含相应的内切核酸酶切割位点的预期哑铃结构。最后，通过外切核酸酶处理破坏未连接的DNA，并纯化外切核酸酶哑铃（图2）。

图2.表达小RNA的最小化哑铃载体的生产策略。该方案包括以下步骤：首先，通过PCR扩增mH1启动子序列。通过PCR引物引入适当的切口酶（NE）和常规限制（RE）位点。第二，使用相应的切口和限制酶消化扩增的启动子DNA。第三，将经消化的DNA纯化，并用T4DNA连接酶进行第四次退火并与发夹DNA模板寡核苷酸连接，形成shRNA（左侧）或miRNA（右侧）表达哑铃载体。添加中和寡核苷酸和柱纯化步骤显着提高了哑铃产量。最后，通过外切核酸酶处理除去未连接的DNA，并使用标准DNA纯化技术纯化哑铃载体DNA（Jiang等人，2016）。

寡核苷酸退火
1. 通过在10μl1x杂交缓冲液中加热500pmol寡核苷酸至95℃3分钟（Thermomixer Comfort，Eppendorf）并使溶液在1小时内冷却至室温来实现sh / miRNA编码DNA发夹的正确折叠。
2. 该方案中的mH1启动子已经通过引入反向转录终止子而被修饰。因此，将寡核苷酸mH1-Fw和mH1-Rv溶于无核酸酶的蒸馏水中至浓度为100μM。通过加热至95℃3分钟（Thermomixer Comfort，Eppendorf），在10μl1x杂交缓冲液中退火500pmol，然后在1小时内将溶液冷却至室温（注1）。
mH1启动子序列的PCR扩增
1. 将以下组件添加到薄壁PCR管中：
2. 使用以下热循环仪条件进行PCR：
  
  按照制造商的建议，使用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化PCR产物。＆nbsp;
PCR产物的内切核酸切割
1. 在室温下按照所示顺序合并反应组分：
2. 将反应混合物在37℃孵育4小时，然后在85℃孵育5分钟以灭活酶（注2）。＆nbsp;
3. 然后根据制造商的建议（注3），用PCR QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化消化的DNA。
  ＆nbsp;
mH1启动子和sh / miRNA编码的发夹寡核苷酸的退火和连接
1. 启动子DNA和sh / miRNA编码发夹寡核苷酸的退火是通过将1x杂交缓冲液中的每种DNA等摩尔量（80pmol）加热至95℃3分钟（Thermomixer Comfort，Eppendorf）并使溶液冷却至室1小时内温度。
2. 退火后，连接反应按照指示顺序设置（注4）：
3. 将反应混合物在22℃孵育4小时或过夜，然后在80℃下孵育10分钟以灭活酶（注5）。
4. 从反应混合物中取出样品（1-2μl）进行凝胶电泳分析
外来核酸酶处理和纯化哑铃形载体
1. 在上述200μl连接混合物中加入1μlT7 DNA聚合酶（10 U /μl），37℃孵育1 h，然后在80°C孵育10 min，使酶失活（注6）。
2. 从反应混合物中取出样品（1-2μl）进行凝胶电泳分析
3. 对取出的样品进行分析性1.5％琼脂糖凝胶电泳，以监测哑铃载体DNA的转化产率和纯度（图3）。
4. 使用标准苯酚/氯仿提取纯化哑铃DNA，然后乙醇沉淀。详细地，将等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）加入到水性哑铃溶液中，旋涡30秒，并通过离心（5分钟，13,000xg）分离水相和有机相）。将上层水相转移到新的Eppendorf管中，并重新提取苯酚残留物。因此，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），用手严格摇动30秒，并通过离心（30秒，13,000×g / g）分离相。将上层水相转移到新的Eppendorf管中，并重复两次重萃取过程（注7）。对于乙醇沉淀，用蒸馏水将水相加至400μl，然后加入0.1体积（40μl）3M乙酸钾（pH 4.8），然后加入2.5体积（1,100μl）乙醇，将溶液混合，在-20℃下孵育20分钟。通过以13,000 x g，4℃离心15分钟使DNA沉淀。然后将颗粒风干。将纯化的DNA溶解在TE缓冲液或蒸馏水中
  
  图3.不同处理后哑铃载体DNA的分析凝胶电泳。其他处理增加了哑铃转换产率：基本方案（1），中和寡聚（50 pmol）的基本方案（2），基本方案与柱纯化（使用QIAgen PCR纯化试剂盒和QIAgen的以下标准方案）（3）和两种处理的基本方案（4）。中和寡聚体结合在切割酶切割后释放的寡核苷酸，并防止这可能再次结合到产生的突出端。柱纯化除去小切割产物并防止它们在随后的连接步骤中降级。通过另外的柱纯化步骤实现了最高的转化率（91％）。转化产率定义为当比较核酸外切酶处理前后预期哑铃的大小时获得的产量。 CP，柱纯化; Neu，中和寡核苷酸（Jiang等人，2016）。

数据分析

哑铃DNA转化产率分析：

使用魔杖工具使用ImageJ测量电泳凝胶中与哑铃产品相对应的DNA条带的强度。
通过将外切核酸酶处理后的条带的强度除以连接样品中相应条带的强度来计算转化产率。

笔记

或者，可以通过从质粒DNA pSuper-mH1的PCR扩增产生mH1序列，其通过将杂交的寡核苷酸克隆到pSuper碱性质粒中构建。为了将退火的序列插入pSuper碱性质粒，首先用EcoRI和BglⅡ在37℃下消化载体（1μg）4小时。消化后，使用QIAgen PCR Purification Kit纯化DNA。使用等摩尔量（0.25pmol）消化的载体骨架进行连接，并在22℃退火插入物4小时。通过测序确认正确的克隆。如果使用pSuper-mH1进行PCR反应，则使用10ng作为模板
根据Taki等人先前的报告，我们使用Nb.Bpu10I作为切口酶。（2004年）。酶供应10倍缓冲液R，但是在咨询了赛默飞世尔技术支持后，使用通用的10倍缓冲液FD。
虽然这一步骤的消化产物可以直接用于连接，我们发现一个额外的纯化步骤可以大大提高哑铃转化率，如图2所示。
在一些情况下，将中和寡核苷酸加入到连接反应中以抑制短切片段的再退火（参见图2）。在用1mM最终ATP补充的FD缓冲液中进行连接，而不是连接缓冲液，因为包括连接酶的所有酶在该缓冲液中为100％活性。为了连接sh / miRNA编码的发夹模板和启动子DNA，我们按照如前所述的核酸酶（ELAN）技术进行酶连接辅助（Cost，2007）。将sh / miRNA编码的发夹寡核苷酸序列PAGE纯化，可直接用于连接
根据我们的经验，连接反应在4小时内完成，较长的孵育时间没有提高哑铃产量。
T7 DNA聚合酶在FD缓冲液中显示出100％的活性，因此直接加入到连接混合物中
必须用手摇动，而不是旋涡，以便有效地混合相位。

食谱

10x杂交缓冲液
1 M NaCl
100mM MgCl 2
200mM Tris-HCl，pH7.4
TE缓冲区
10mM Tris-HCl，pH8.0
1 mM EDTA

致谢

这里描述的协议在以前在Jiang等人开发和使用。（2016）。新加坡国立大学新加坡国立医科大学附属新加坡国立大学新加坡国立医学研究委员会（新加坡国立医学研究理事会，新加坡国立医科大学核医学研究中心，新加坡国立医科大学，尼日利亚国立大学，尼日利亚共和国），以及教育部新加坡[学术研究基金（AcRF）第1级教师研究委员会（FRC）授予T1-2011Sep-04和T1-2014Apr-02以及“基础科学研究种子基金”号T1-BSRG 2015-05]。作者宣称相互竞争的经济利益。涵盖主要工作的专利申请正在等待。

参考

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