材料和试剂

1.7ml微管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-175-C）
移液器提示
Cheesecloth Miniwipes（Fisher Scientific，目录号：06-665-28）
锋利刀片（红魔，目录号：3272）
Bond-Elute C-18 SPEC板（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）
种子种子的选择。对于Solanum lycopersicum的方法开发种子cv。 Moneymaker（Accesion：LA2706）和cv。使用红色设置器
液氮
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-500）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P9599）
6x Laemmli缓冲液（Alfa Aesar，目录号：J61337）
尿素（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：29700）}
丙烯酰胺/双丙烯酰胺（Fisher Scientific，目录号：BP1408-1）
TEMED（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：17919）}
过硫酸铵（Acros Organics，目录号：327081000）
乙腈（Fisher Scientific，目录号：A9561）
甲酸（Fisher Scientific，目录号：A117-50）
硼酸（Fisher Scientific，目录号：A73-500）
硝酸钙四水合物（Fisher Scientific，目录号：C109-500）
无水硫酸镁（Fisher Scientific，目录号：M65-500）
硝酸钾（Fisher Scientific，目录号：P263-500）
氯化钾（Fisher Scientific，目录号：P217-500）
二硫苏糖醇（DTT）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：R0861）}
乙二胺四乙酸，脱水二钠盐（EDTA）（Fisher Scientific，目录号：S311-100）
Tris基（Fisher Scientific，目录号：BP152-500）
甲醇（Fisher Scientific，目录号：A456-1）
乙酸（Fisher Scientific，目录号：A507-P500）
双蒸水
考马斯亮蓝R-250（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：20278）}
胰蛋白酶溶液测序级（Roche Diagnostics，目录号：11418475001）
碳酸氢铵（Fisher Scientific，目录号：A643-500）
氯化钙（Fisher Scientific，目录号：C70-500）
三氟乙酸（TFA）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：28904）}
萌发溶液（见配方）
均质缓冲液（见配方）
染色溶液（参见食谱）
解决方案（见配方）
胰蛋白酶缓冲液（参见食谱）

设备

涡旋（例如，Fisher Scientific，型号：Fisher Scientific ^{TM Analog Vortex Mix，目录号：02-215-365）}
离心机（例如，Eppendorf，型号：5424R）
超速离心机（例如，Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall发现^{TM 90 / SE>}
雏菊BB（雏菊，型号：24，目录号：980024-001）
Tissuelyser II（QIAGEN，型号：Tissuelyser II，目录号：85300）
Speed-Vac Labogene ApS（LabGene ^{TM，型号：ScanVac CoolSafe 110-4，目录号：H01130032）}
移液器
超声波发生器（BANDELIN electronic，型号：Sonorex RK 100，目录号：301.00044253.024）
Precolumn（Eksigent，Redwood City，CA，USA）
Ascentis色谱柱（Sigma-Aldrich，Supelco，型号：Ascentis Express Peptide ES-C18 HPLC柱，目录号：53552-U），尺寸15×100μm，孔径2.7μm
Orbitrap LTQ XL质谱仪（Thermo Fisher Scientific，型号：LTQ XL ^{TM ）}

软件

Proteome Discoverer 1.3（Thermo，德国）或其他软件，如MaxQuant（ http：//www.maxquant .org / ），Protmax（ http：/ /www.univie.ac.at/mosys/software.html ）和MASCOT（ http://www.matrixscience.com/ ）

PROMEX（ http://promex.pph.univie.ac.at / promex / ）或其他软件，如ProteomeXchange（ http：//www.proteomexchange .ORG / ）

程序

成熟花粉收获
1. 在控制的温室条件下（番茄：24℃/ 20℃，白天/晚上; 60日龄）生长植物（例如，以下为番茄cv。Moneymaker-MM，以及cv。Red setter-RS）％湿度（Fragkostefanakis等人，2015）。
  注意：生长条件需要适应正在使用的植物物种或品种。
2. 在开花后从花芽收获花药（MM和RS的长度> 10 mm），因为它们含有成熟的花粉粒（优选时间是开花后0-72小时）。
3. 对收集的花药进行水平切割，并将四个花药放入含有500μl发芽液的1.7ml微量管中。
4. 使用移液管吸头用轻微的机械应力挤压花药组织并涡旋15-20秒，以从花药室释放成熟花粉。
5. 此外，通过干酪布通过含有分离的成熟花粉粒的发芽溶液以除去另外的碎片
6. 在4℃下将收集的花粉颗粒以10,000xg离心15分钟。
7. 取出上清液，用200微升萌发溶液洗涤颗粒状花粉颗粒，并在4℃下以10,000×g离心1分钟。
8. 取出上清液，重复洗涤步骤A7。
9. 取出上清液，将收集的花粉浸入液氮中，储存于-80°C直至进一步使用
隔膜富集级分
1. 添加金属珠（雏菊BB），帮助将组织均匀化成微管，并用组织培养器II研磨收集的成熟花粉粒（以25 /秒1分钟）。
2. 加入含有氯化钠（NaCl，750mM）和蛋白酶抑制剂混合物的10-20ml均质缓冲液至研磨的成熟花粉中，重新悬浮并在冰上放置30分钟。
3. 将匀浆的混合物在10℃下离心，在4℃下离心60分钟
4. 将沉淀重新悬浮在Laemmli缓冲液中，并定量测定蛋白质浓度。
  注意：上清液富含可溶性蛋白质，如果需要，也可以进行霰弹枪蛋白质组学方案。
猎枪蛋白质组学
1. 将40μg总蛋白加载到SDS-PAGE（12.5％，最大厚度为1mm）上，并以80V恒定的凝胶运行1.5cm的解析凝胶（Valledor and Weckwerth，2014）。 Laemmli缓冲区用作加载缓冲区。
2. 用甲醇：乙酸：水：考马斯亮蓝R-250（40：10：50：0.001）染色凝胶30分钟，并在甲醇：水（40:60）中脱色一夜。然后，从剩余的凝胶中切下厚的堆叠蛋白质条带，并用锋利的刀片将其切成较小的碎片。将切碎的凝胶片浸入双蒸水中，直到所有样品被处理
3. 然后取出水，加入1ml碳酸氢钠（25mM），37℃孵育15分钟。弃上清，加入1ml 25mM碳酸氢钠和50％乙腈。将样品在37℃孵育15分钟。重复此步骤。
4. 去除上清液，并在室温下将300μl100％乙腈中的凝胶片脱水5分钟。弃上清液，并在Speed-Vac中干燥5分钟注意：凝胶片应该具有“透明塑料”的外观。如果凝胶片仍然是半透明的，请重复步骤。
5. 用50μl胰蛋白酶溶液（10ng /μl）对切碎的凝胶片进行消化，并在37℃下孵育15分钟。如果需要，加入更多的胰蛋白酶溶液，直到凝胶片完全再水合。在37°C孵育14-16 h，避免孵化期间发生振荡。然后，加入5μl的1.0％三氟乙酸（加入TFA后，pH <4）停止反应。
  注意：加入1 ml胰蛋白酶缓冲液，将胰蛋白酶稀释至10 ng /μl。在冰上孵育10分钟，然后上下移液以完全重新悬浮沉淀。稀释后，胰蛋白酶可以在-20°C保存一个月。强烈建议将其存放在等分试样中（Valledor and Weckwerth，2014）。
6. 对于肽提取，将150μl50％乙腈（v / v）和1％甲酸（v / v）加入到含有凝胶片的微管中，并在室温下孵育5分钟，然后超声处理3分钟（低强度超声波浴）。
7. 旋转微管（1000×g 1分钟），并将上清液收集在新的微管“A”中。重复步骤C6并将上清液转移到微管“A”
8. 加入100μl90％乙腈（v / v）和1％甲酸（v / v）到含有凝胶片的微管中，并在室温下孵育5分钟。将上清液转移到微管“A”
9. 在Speed-Vac（微管A）中干燥样品。长期保存提取的肽-80℃是优选的
10. 然后，使用规格96孔C18，Agilent（Valledor和Weckwerth，2014）进行肽脱盐。
11. 将肽溶解于4％（v / v）乙腈，0.1％（v / v）甲酸中。
12. 将消化的肽注入具有预柱的一维纳流LC-MS / MS系统。
13. 用Ascentis柱在80分钟内洗脱肽，梯度为5％至50％（v / v）乙腈，0.1％（v / v）甲酸，并在Orbitrap LTQ XL质谱仪上进行质谱分析，控制流量为500 nl每分钟，MS的特定调谐设置如下：喷射电压设置为1.8 kV;加热的转移毛细管的温度设置为180°C。
14. 在每次完整的MS扫描后，执行10次MS / MS扫描，并动态选择十个最丰富的肽分子离子，动态排除窗口设置为90秒。
15. 在MS / MS分析的完整MS中，省略+1或未识别电荷状态的离子。

数据分析

霰弹枪蛋白质组学分析
1. 使用Proteome Discoverer 1.3版本中的SEQUEST算法搜索获得的原始数据（以质谱的形式）。为此，将识别置信度设置为5％FDR（假发现率）和对N-末端的乙酰化和甲硫氨酸的可变修饰，母体离子的质量公差为10ppm，碎片离子为0.8Da。 br />
2. 将肽与相应植物物种的基因组序列匹配，在这种情况下为番茄（Sol Genomics Network），并且当肽置信度处于中等或高时考虑到显着的命中，并且以每次充电1为1建立Xcorr阈值（2为+ 2离子，3个用于+3离子，等等）。
  注意：选择高阈值以最小化蛋白质的错误检测。
膜蛋白的预测
首先，使用像ARAMEMNON这样的数据库来预测膜蛋白（Schwacke等人，2003）。 ARAMEMNON分别考虑20和11个不同的数据库（或算法）来分别预测α-螺旋和β-桶蛋白。
1. 如果您感兴趣的植物种类没有在ARAMEMNON中列出，您可以通过成熟的方法预测检测到的蛋白质的共同直系同源物（Simm等人，2015年））。
2. 检测到的蛋白质应通过第二个程序（如THMMM）进行验证（ http： //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ ），其预测基于隐马尔可夫模型的跨膜α螺旋（Krogh等人，2001）。

食谱

萌发方案
2 mM硼酸
2mM硝酸钙四水合物
2毫摩尔无水硫酸镁
1mM硝酸钾/ / 准备100ml混合物：
0.012g硼酸
0.047g硝酸钙四水合物
0.024克无水硫酸镁 0.010g硝酸钾/ /
均质缓冲液
100 mM氯化钾 5 mM DTT
1 mM EDTA
50 mM Tris pH 7.2
750 mM氯化钠
准备100ml混合物：
0.745克氯化钾
0.077g DTT
0.029g EDTA
0.605g Tris pH7.2
注意：根据匀浆缓冲液，最后加入氯化钠;对于20ml均质缓冲液，加入0.876g氯化钠。
染色溶液
甲醇：乙酸：水：考马斯亮蓝R-250（40：10：50：0.001）
解决方案
甲醇和水（40:60）
胰蛋白酶缓冲液
25 mM碳酸氢钠
10％（v / v）乙腈 5 mM氯化钙准备100ml混合物：
0.21克碳酸氢钠
100μl纯乙腈
645微升水
注意：根据胰蛋白酶缓冲液，最后添加钙。对于10ml胰蛋白酶缓冲液，加入0.005克氯化钙。

致谢

该协议来自（Paul等人，2016a）。这是由Marie-Curie（欧盟赠款协议号289220）资助的SPOT-ITN联盟的一篇文章。

参考

Chaturvedi，P.，Ghatak，A.和Weckwerth，W。（2016）。花粉蛋白质组学：从压力生理学到发育启动。植物生殖发育 29（1-2）：119-32。

Chaturvedi，P.，Ischebeck，T.，Egelhofer，V.，Lichtscheidl，I。和Weckwerth，W。（2013）。＆nbsp; 从花粉母细胞到成熟花粉的番茄花粉蛋白质组的细胞特异性分析为发育启动提供了证据。 em> 12（11）：4892-4903。

Fragkostefanakis，S.，Simm，S.，Paul，P.，Bublak，D.，Scharf，KD和Schleiff，E.（2015）。＆nbsp; 通过转录组分析和微阵列荟萃分析研究的Solanum lycopersicum中的分子伴侣网络组合植物细胞环境38（4）：693-709。

Krogh，A.，Larsson，B.，von Heijne，G.and Sonnhammer，EL（2001）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov / pubmed / 11152613“target =”_ blank“>使用隐马尔可夫模型预测跨膜蛋白拓扑：应用于完整的基因组。 J Mol Biol 305（3）：567-580。 br />

Paul，P.，Chaturvedi，P.，Selymesi，M.，Ghatak，A.，Mesihovic，A.，Scharf，KD，Weckwerth，W.，Simm，S。和Schleiff，E.（2016a）一个class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26455813”target =“_ blank”>茄属茄子中雄配子体的膜蛋白质组> 蛋白质组学 131：48-60。

Paul，P.，Roth，S。和Schleiff，E.（2016b）。细胞器蛋白质的重要性，蛋白质易位和囊泡运输途径，用于花粉发育和功能。植物生长 29（1-2）：53-65。 >

Paul，P.，Simm，S.，Blaumeiser，A.，Scharf，KD，Fragkostefanakis，S.，Mirus，O. and Schleiff，E。（2013）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href = “http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23506162”target =“_ blank”>植物中的蛋白质易位系统 - 茄子茄子的实例的组成和变异性 / a> BMC基因组学 14：189.

Paul，P.，Simm，S.，Mirus，O.，Scharf，KD，Fragkostefanakis，S。和Schleiff，E.（2014）。通过正交搜索检查的植物中囊泡运输因子的复杂性 9（5）：e97745。

Pertl，H.，Schulze，WX和Obermeyer，G。（2009）。花粉细胞膜蛋白质组在百合花粉的发芽和管生长期间显示出高度的空间 - 时间动力学.J蛋白质组Res。8（11）：5142-5152。 />

Schwacke，R.，Schneider，A.，van der Graaff，E.，Fischer，K.，Catoni，E.，Desimone，M.，Frommer，WB，Flugge，UI and Kunze，R。（2003） ARAMEMNON，一种用于拟南芥的新颖数据库整体膜蛋白。植物生理131（1）：16-26。

Simm，S.，Fragkostefanakis，S.，Paul，P.，Keller，M.，Einloft，J.，Scharf，KD和Schleiff，E.（2015）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href = “http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25698879”target =“_ blank”>番茄茄子中核糖体生物发生因子共同直系同源物的鉴定和表达分析 Bioinform Biol Insights 9：1-17。

Valledor，L.和Weckwerth，W.（2014）。＆nbsp; 改进的与洗涤剂相容的凝胶分离LC-LTQ-Orbitrap-MS植物和微生物蛋白质组学工作流程。 Methods Mol Biol 1072：347-358。