材料和试剂

移液器提示
1.5 ml管（Eppendorf）
50ml管（Falcon管）
聚-L-赖氨酸包被的载玻片（Sigma-Aldrich，目录号：P0425-72EA）
封面
培养皿
过滤器孔径为0.2μm
丝状蓝细菌，鱼尾草 sp。 PCC7120
用10mM NaHCO 3（Rippka，1988）
提供的BG-11液体
碳酸氢钠（NaHCO 3）（EMD Millipore，目录号：106329）
乙醇（EMD Millipore，目录号：1.00983.2500）
Triton X-100（Winkler Limitada，目录号：BM-2020）
牛血清白蛋白（BSA）（Divbio Science，目录号：41-903-100）
Tween-20（Winkler Limitada，目录号：TW-1652）
第二抗体Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A11008）
ProLong Gold Antifade Mountant（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM ，目录号：P36930）}
指甲油
针对All2320肽的原代多克隆抗体（Mandakovic等人，2016）
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：106404）
氯化钾（KCl）（EMD Millipore，目录号：104938）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（EMD Millipore，目录号：106559）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（EMD Millipore，目录号：529568）
PBS缓冲液（pH 7.4）（见配方）

设备

移液器
疏水PAP笔（Thermo Fisher Scientific，目录号：008877）
-20°C冷藏柜
4℃培养箱
孵化器在55°C
孵化器在24°C与白光
Olympus Fluoview FV1000共聚焦显微镜（Olympus，型号：Fluoview ^{TM FV1000）和60x / 1.35 NA油浸和100x / 1.40 NA油浸的目标。激光氩弧488（激发495nm，发射509nm）和激光线DPSS（激发565nm，发射590nm）}
水分箱（内置湿纸的深色塑料盒，PolarSafe ^{TM聚丙烯冷冻储存盒）（Argos Technologies，目录号：R3130）}

软件

ImageJ软件（ https://imagej.net ）

程序

生物和生长条件
1. 鱼尾鱼 sp。 PCC7120在BG-11液体介质中24℃，白光（25μmol/平方米/秒）下生长并以90rpm摇动。 >
固定和透化
1. 将50μl蓝细菌培养物（OD 750×0.3）加入到聚赖氨酸显微镜载玻片中，并在55℃下干燥20分钟。不要用有机溶剂或醛固定细胞。
2. 将细胞斑点固定在70％乙醇中，并在-20℃下孵育30分钟。将载玻片浸入含有培养皿的70％乙醇中
3. 将载玻片在室温下风干20分钟。
4. 使用疏水PAP笔在载玻片安装的细胞斑点周围绘制一圈，并在室温下干燥15分钟。
标签程序
1. 通过在PBS中加入0.05％Triton X-100滴定2分钟使细胞渗透稳定，每次用移液管移除滴液，重复三次。
2. 在4℃下，在潮湿室中，用PBS中的3％BSA，0.2％Triton X-100滴加1小时，并除去该封闭溶液。
3. 将细胞与1％BSA稀释的1％BSA，0.05％Tween-20在PBS中的溶液一起稀释。在含有1％BSA，0.05％Tween-20的PBS溶液中以1:100稀释的预免疫血清用作对照，以确保一抗能正常工作。将溶液的细胞在4℃下，在水分室中孵育2小时
4. 用PBS中的0.05％Triton X-100在室温下洗涤2分钟，重复三次
5. 与第二抗体Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（在含有1％BSA和0.05％Tween-20的PBS中稀释，最终浓度为10μg/ ml）在4℃下在水分室中孵育45分钟。 >
6. 用PBS中的0.05％Triton X-100在室温下洗涤3次
7. 在样品载玻片上加入一滴Prolong Antifade试剂，然后盖上盖子，同时注意不要产生气泡。用指甲油密封。
8. 使用Fluoview FV1000共焦显微镜可视化幻灯片，并以16位获取图像。 Alexa Fluor 488在495nm的波长下激发，并且在509nm处测量发射。为了使由phycobillisomes引起的自发荧光可视化，使用565nm激发样品，并在590nm监测荧光发射（图1）。
  
  图1. Cydiv在鱼腥藻中的免疫定位 PCC7120。 Z-stack的解卷积图像。 A.自发荧光B.来源于一抗抗体CyDiv和二抗Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG的图像信号; C.自发荧光和CyDiv-Alexa Fluor 488荧光的合并图像。白色比例尺=5μm。

数据分析

使用ImageJ软件（Schneider等人，2012）处理Z堆叠的图像。对于每个图像通道，使用PSF Generator插件（Kirshner等人，2013年）中的Born和Wolf模型计算点扩散函数（PSF）。使用具有Richardson-Lucy算法的Deconvolution Lab插件，使用10次迭代进行图像去卷积（Vonesch和Unser，2008）。

食谱

PBS缓冲液（pH 7.4）
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
1.4mM Na 2 HPO 4
1.4mM KH 2 PO 4
注意：PBS通过孔径为0.2μm的过滤器过滤，并在室温下储存。

致谢

所描述的方案已经从（Plominsky等人，2013; Miyagishima等人，2014）修改。这项工作得到Fondecyt拨款＃1131037,1161232和智利政府研究生奖学金＃21100780和21150983的支持。

参考

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