材料和试剂

1.5 ml微量离心管
0.2 ml PCR管
一次性移液器吸头
Oligo dT 列（QIAGEN，补充有Oligotex mRNA迷你试剂盒[QIAGEN，目录号：70022]）
STBL4电感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11635018）}
慢病毒载体
lentiCRISPR v2（Sanjana等人，2014）（Addgene，目录号：52961）
寡核苷酸
半随机引物p NNNCCN
RNA转录本（SMART）标签上的5'切换机制TGGTCAAGCTTCAGCAGATCTACACGGACGTCGCrGrGrG
5'SMART PCR引物TGGTCAAGCTTCAGCAGATCTACACG
3'接头I转发pCTGCTGACTTCAGTGGTTCTAGAGGTGTCCAA
3'接头I逆转GTTGGACACCTCTAGAACCACTGAAGTCAGCAGT
5'连接器我转发GCATATAAGCTTGACGTCTCTCACCG
5'连接子I逆转NNCGGTGAGAGACGTCAAGCTTATATGC
3'连接子II正向p GTTTGGAGACGTCTTCTAGATCAGCG
3'接头II反向CGCTGATCTAGAAGACGTCTCCAAACNN
3'连接子I PCR引物GTTGGACACCTCTAGAACCACTGAAGTCAGCAGTNNNCC
3'接头II PCR引物CGCTGATCTAGAAGACGTCTCCAAAC
LentiCRISPR转发CTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACG
LentiCRISPR反向CGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAG
TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15596026）}
苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1（Sigma-Aldrich，目录号：P2069-100ML）
乙醇
无RNase的水
Oligotex mRNA Mini Kit（QIAGEN，目录号：70022）
T4 DNA连接酶反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0202S）
SMART Scribe逆转录酶（Takara Bio，Clontech，目录号：639536）
DTT（Takara Bio，补充有SMART Scribe逆转录酶[Takara Bio，Clontech，目录号：639536]）
dNTP混合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：18427013）}
RNaseOUT（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10777019）}
RNase H（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：18021014）}
MilliQ水
Advantage 2聚合酶混合物（Takara Bio，Clontech，目录号：639201）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
快速连接套件（New England Biolabs，目录号：M2200S）
EcoP15I（New England Biolabs，目录号：R0646S）
Bgl II（New England Biolabs，目录号：R0144S）
Acu I（New England Biolabs，目录号：R0641S）
Xba I（New England Biolabs，目录号：R0145S）
Bsm BI（New England Biolabs，目录号：R0580S）
II。（II New England Biolabs，目录号：R0117S）
10-bp梯形图
1x CutSmart缓冲区（包括在Xba I [New England Biolabs，目录号：R0145S]）
S-腺苷甲硫氨酸（SAM）（New England Biolabs，补充有Acu I [New England Biolabs]）
3 M醋酸钠（pH 5.5）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM9740）}
丙烯酰胺/双溶液（19:1）（40％w/v，5％C）（SERVA电泳，目录号：10679.01）
糖原（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：R0561）
Qubit dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：Q32851）}
TE缓冲液（pH 8.0）（参见食谱）

设备

移液器
Centifuge（Eppendorf，型号：5424 R，5810 R）
加热块
玻璃烧杯
GeneAmp PCR System 9700（Thermo Fisher Scientific，型号：GeneAmp PCR System 9700）
注意：本产品已停产。
Mini-PROTEAN四立式电泳池（Bio-Rad Laboratores，型号：Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell）
GenePulser II（Bio-Rad Laboratores，型号：Gene Pulser II）
高性能实验室孵化器2800（F.lli GALLI，型号：MOD。2800）
CLC Genomics Workbench（QIAGEN，型号：CLC Genomics Workbench）
生物分析仪（Agilent Technologies）
高压灭菌器

程序

总RNA制备
1. 通过重复移取，用10 ml的TRIzol溶解细胞。在室温下孵育5分钟。
2. 加入2毫升氯仿。用手摇动15秒。在室温下孵育2-3分钟。在4℃下以12,000 x g离心15分钟。
3. 将水相转移到新鲜管中。加入5ml异丙醇，充分混匀。在4℃下以12,000 x g离心10分钟。
4. 去除上清液。用80％乙醇洗涤沉淀一次。空气干燥沉淀5-10分钟
5. 通过移液将RNA溶解在1ml无RNase的水中，然后在55-60°C下将样品孵育10分钟。
PolyA RNA制备（见注1）
1. 使用Oligotex mRNA Midi Kit。将Oligotex悬浮液加热至37°C。加热块上加热缓冲液OEB至70°C。混合缓冲液OBB很好。
2. 将500μg总RNA吸入无RNA酶的1.5 ml微量离心管中，并用无RNase的水调节体积至1 ml。
3. 加入500μl缓冲液OBB和30μlOligotex悬浮液。
4. 在70℃下孵育3分钟。从热中取出。
5. 在室温下孵育10分钟。
6. 在15,871 xg离心2分钟。通过移液去除上清液。
7. 加入250μl无RNase的水和250μl缓冲液OBB。通过移液彻底混合内容。
8. 在70℃下孵育3分钟。从热中取出。
9. 在室温下孵育10分钟。
10. 在15,871 xg离心2分钟。通过移液去除上清液。
11. 将沉淀重悬于400μl缓冲液OW2中。将混合物吸入置于1.5 ml管中的小型旋转柱上。在15,871 xg离心1分钟。
12. 将旋转柱转移到新的无RNA酶的1.5-ml管中。应用400μl缓冲液OW2。将其吸入置于1.5ml管中的小旋转柱上。在15,871 xg离心1分钟。
13. 将旋转柱转移到新的无RNA酶的1.5-ml管中。将25μl热（70℃）缓冲液OEB吸入柱上。吸管上下3-4次以重悬树脂。在15,871 xg离心1分钟。
14. 将另外25μl热（70℃）缓冲液OEB吸取到柱上。吸管上下3-4次以重悬树脂。在15,871 xg离心1分钟。
链接器准备
1. 将以下试剂合并到1.5ml微量离心管中：将10μl100μM连接子前向寡核苷酸，10μl100μM连接子反向寡核苷酸和2.2μl10×T4DNA连接酶缓冲液（New England Biolabs）。
2. 将管置于含有2升开水的玻璃烧杯中，孵育管直到水自然冷却至室温。
3. 用77.8μlTE缓冲液（pH 8.0）稀释退火的寡核苷酸，并使用10μM接头。
第一链cDNA合成
1. 将以下试剂合并在0.2ml PCR管中：200ng聚（A）RNA（来自步骤A2），0.6μl25μM半随机引物和4.75μl体积的无RNA酶的水。
2. 在热盖热循环仪中将管孵育72分钟3分钟，在冰上冷却2分钟，并进一步在25℃下孵育10分钟。
3. 将温度升至42℃，加入以下试剂的5.25μl混合物：0.5μl25μM5'SMART标签，2μl5x SMART Scribe缓冲液，0.25μl100mM DTT，1μl10mM dNTP混合物，0.5μlRNaseOUT（Invitrogen）和1μlSMART Scribe逆转录酶（100U）（Clontech）。
4. 将第一链cDNA反应混合物在42℃孵育90分钟，然后在68℃孵育10分钟。要降解RNA，将1μlRNA酶H（Invitrogen）加入到混合物中，并将混合物在37℃下孵育20分钟。
通过引物延伸的双链（ds）cDNA合成
1. 将11μl制备的第一链聚（A）cDNA（来自步骤C4）与74μlMilliQ水，10μl10x Advantage 2 PCR缓冲液，2μl10mM dNTP混合物，1μl25μM5' SMART PCR引物和2μl50x Advantage 2聚合酶混合物（Clontech）。
2. 孵育100μl体积的反应混合物，在95℃下引物延伸1分钟，68℃20分钟，然后70℃10分钟。
3. 使用QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化制备的ds cDNA，并用40μlTE缓冲液（pH 8.0）洗脱DNA。
3'连接子连接
1. 在1x快速连接缓冲液中混合0.5μl10μM3'接头I和1μlQuick T4 DNA连接酶（New England Biolabs; NEB）的ds聚（A）cDNA（来自步骤D3）。
2. 将连接反应混合物在室温下孵育15分钟，然后使用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化，并用80μlTE缓冲液洗脱。
EcoP15I消化
1. 在含有1x ATP的1x NEBuffer 3.1中，在100μl体积的37℃下将3'连接体I连接的DNA（来自步骤E2）与1μlEcoP15I（10U /μl，NEB）一起消化过夜。
2. 使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化EcoP15I消化的DNA，并用40μlTE缓冲液洗脱DNA。
5'连接子I连接和Bgl II消化
1. 将消化的DNA（来自步骤F2）与0.5μl10μM5'接头I和1μlQuick T4 DNA连接酶（NEB）在1x快速连接缓冲液中混合。
2. 在室温下孵育连接反应混合物15分钟，使用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化，并用80μlTE缓冲液洗脱。
3. 用1x NEBuffer 3.1中的1μlBgl II（10U /μl，NEB）（参见注释2）在37℃下将DNA消化3小时。
4. 使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化EcoRI15I/Bgl II消化的DNA，并用50μlTE缓冲液洗脱DNA。
第一次PCR优化（见注3）
1. 为了确定PCR循环的最佳数量，制备含有5μl连接于5'连接体I/3'连接体I（来自步骤G4）的ds cDNA的0.2ml PCR管，0.5μl25μM连接子I正向引物，0.5μl25μM3'接头I PCR引物，5μl1x Advantage 2 PCR缓冲液，1μl10mM dNTP混合物，1μl50x Advantage 2聚合酶混合物和50μl体积的MilliQ水。
2. 使用以下循环参数进行PCR：6个循环，98℃10秒和68℃10秒。
3. 6个循环后，将5μl反应转移到干净的微量离心管中。与PCR反应混合物的其余部分进行PCR，再循环3次，98℃10秒，68℃10秒。
4. 经过这3个循环，将5μl转移到干净的微量离心管中。
5. 以相同的方式，重复另外的PCR直到达到30个总循环。因此，制备6,9,12,15,18,21,24,27,30个循环的一系列PCR反应，并通过20％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，以比较条带模式（图2; PCR优化1）。
  
  图2.第一次PCR循环优化和大小分级（Arakawa，2016）。 PCR产物在20％聚丙烯酰胺凝胶上运行。使用10-bp的梯子作为大小标记。预期尺寸的条带用三角形标记。（见注4）
6. 确定PCR循环的最佳数量作为产生最大量的84-bp产物的PCR循环的最小数量（通常约17个循环）。
7. 重复两次50μlPCR反应，最佳PCR循环次数。
8. 使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并用50μlTE缓冲液洗脱
我的消化我的Xba Acu
1. 用2μl的AcuI（5U /μl，NEB）和2μl的XbaI（20U /μl，NEB）将PCR产物（来自步骤H8）消化）（见注2）在含有40μMS-腺苷甲硫氨酸（SAM）的1x CutSmart缓冲液中，在37℃下60μl体积过夜。
粉碎和浸泡的程序
1. 在20％聚丙烯酰胺凝胶上运行I-digest DNA（来自步骤I1）的Xba I/XbaI（图2;大小分级1）。
2. 将45-bp片段切割出凝胶，并将其转移到微量离心管中。用一次性移液管尖端将凝胶切片压在微量离心管壁上。
3. 向凝胶切片中加入1-2体积的TE。在室温下将管子在旋转轮上孵育过夜。
4. 在4℃下将样品以21,130×g离心1分钟。将上清液转移到新鲜的微量离心管中，小心避免转移聚丙烯酰胺片段。
5. 向聚丙烯酰胺颗粒中加入0.5体积的TE。短暂旋转管。在4℃下将样品以21,130×g离心1分钟。
6. 合并两个上清液，然后在4℃下以21,130×g离心1分钟。将上清液转移到新的微量离心管中，以除去小的PAGE残留物
7. 将样品与0.1体积的3M乙酸钠和1/400体积的20μg/μl糖原混合。向样品中加入2.5体积的冷乙醇，并短暂混合。将溶液储存在冰上30分钟。在4℃下将样品以21,130×g离心20分钟
8. 丢弃上清液。用70％乙醇冲洗沉淀一次
9. 将沉淀溶解于20μlTE缓冲液中
3'连接子II连接
1. 将消化的DNA（来自步骤J9）与2μl10μM3'接头II和1μlQuick T4 DNA连接酶（NEB）在1x快速连接缓冲液中混合。
2. 将连接反应混合物在室温下孵育15分钟，使用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化，并用100μlTE缓冲液洗脱。
第二次PCR优化（见注3）
1. 为了确定PCR循环的最佳数量，制备含有5μl连接于5'连接子I/3'连接体II（来自步骤K2）的ds cDNA的0.2-ml PCR管，0.5μl25μM连接子I前向引物，0.5μl25μM3'接头II PCR引物，5μl1x Advantage 2 PCR缓冲液，1μl10mM dNTP混合物，1μl50x Advantage 2聚合酶混合物和50μl体积的MilliQ水。 br />
2. 使用以下循环参数进行PCR：6个循环，98℃10秒和68℃10秒。 6个循环后，将5μl反应转移到干净的微量离心管中。
3. 与PCR反应混合物的其余部分进行PCR，再循环9个循环，98℃10秒，68℃10秒。
4. 经过这3个循环，将5μl反应转移到干净的微量离心管中。
5. 以相同的方式，重复另外的PCR循环，直到达到18个总循环。
6. 因此，制备6,9,12,15和18个循环的一系列PCR反应，并通过20％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析以比较条带模式（图3; PCR优化2）。
  
  图3.第二次PCR循环优化和大小分级（Arakawa，2016）。 PCR产物在20％聚丙烯酰胺凝胶上运行。使用10-bp的梯子作为大小标记。预期尺寸的条带用三角形标记。（见注4和5）
7. 确定PCR循环的最佳数量作为产生最大数量的72-bp产物的PCR循环的最小数量（通常约9个循环）。
8. 重复5次PCR反应，每次含有50μlPCR PCR循环次数。
9. 使用QIAquick PCR Purification Kit纯化PCR产物，并用100μlTE缓冲液洗脱
bsm BI/ Aat II消化
1. 将来自步骤L9的PCR产物用10μl的Bax BI（10U /μl，NEB）在1x NEBuffer 3.1中以100μl体积在55℃下消化6小时，然后加入将5μl的IIA（20U /μl，NEB）（见注2）给予溶液;将溶液在37℃下放置过夜。
2. 在20％聚丙烯酰胺凝胶上运行II消化DNA的 BI/ Aat 。
3. 通常，对应于25,24和23bp的3个条带是可见的（图2;尺寸分级2）。
4. 将25-bp片段从凝胶中切下，通过如步骤K所述的挤压和浸泡步骤纯化，并将该片段溶解在50μlTE缓冲液中。
5. 通过Qubit dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测量纯化的DNA的浓度
克隆
1. 摘要lenti CRISPR ver。 2（lentiCRISPR v2）（Sanjana等人，2014）（Addgene）与Bsm BI，用小牛肠磷酸酶处理，用酚/氯仿提取，并通过乙醇纯化沉淀。
2. 将5ng纯化的25-bp引导序列片段（来自步骤M5）与3μglentiCRISPR v2和1μlQuick T4 DNA连接酶（NEB）在1×Quick连接缓冲液中以40μl体积混合。
3. 将连接反应混合物在室温下孵育15分钟，然后通过乙醇沉淀纯化。
4. 使用以下电穿孔器条件将制备的gRNA文库电穿孔至STBL4电感受态细胞（Invitrogen）：1,200V，25μF和200Ω。
深度测序
1. 为了扩增引导序列，制备含有1μl100ng /μl慢病毒质粒文库（来自步骤N4），0.5μl25μMlentiCRISPR正向引物，0.5μl25μMlentiCRISPR反向引物，5μl μl1x Advantage 2 PCR缓冲液，1μl10mM dNTP混合物，1μl50x Advantage 2聚合酶混合物和50μl体积的MilliQ水。
2. 用以下循环参数进行PCR：98℃10秒和68℃10秒的15个循环。
3. 使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN），从2％琼脂糖凝胶纯化含有引导序列的100-bp PCR片段。使用TruSeq纳米DNA文库准备工具（Illumina）准备深度测序文库。
4. 使用Miseq（Illumina）的深层次序列（见注6）

数据分析

由Illumina Miseq解复用FASTQ文件。
使用CLC Genomics Workbench（QIAGEN）（见注6）修剪序列读取以排除载体骨架序列，并将PAM序列NGG添加到序列读取中。
使用CLC Genomics Workbench（QIAGEN）中的RNA-seq分析工具箱，将这些序列读数与参考基因组对齐。

笔记

聚（A）RNA的质量是影响图书馆质量的最重要因素之一（程序B）。在建立gRNA文库构建方法时，在使用寡核苷酸柱纯化的poly（A）RNA中观察到rRNA污染，并且rRNA起始的引导序列有时占总原始数的40-50％图书馆。由于rRNA占细胞内RNA的90％以上，一般而言，很难避免出现一些rRNA污染。生物分析仪（Agilent）可以检测rRNA污染水平。如果大量的rRNA被污染，则必须重复用缓冲液OBB洗涤步骤（步骤B7-B10）。或者，rRNA耗尽试剂盒可以并入该方案以减少rRNA污染。
在设计方法时也观察到扩增接头序列的PCR伪影。为此，针对5'SMART标签（步骤H3），对于3'连接子I，具有另外的限制性位点，即Bgl II，（步骤J1）和对于5'连接体I和3'连接体II的IIA（步骤N1）。通过用这些额外的限制酶切割，可以去除扩增接头序列的大部分PCR伪影。
因为针对Advantage 2聚合酶（Clontech）对PCR条件进行了优化，我建议使用Advantage 2，这是对于复杂cDNA文库的有效扩增的最佳选择（方法I和程序M）。如果其他聚合酶用于PCR，必须优化PCR条件，如循环数，引物浓度或模板量。
PCR周期数必须仔细滴定，因为所需的PCR产物将通过PCR的过度循环减少或丧失（图2和3）。
除了一个或两个bp短的意想不到的DNA片段之外，最终PCR反应的Bsm BI限制性消化产生正确大小的DNA片段（25bp）（图3）。这些较短的DNA片段可能是由于III型和IIS型限制酶的切割位置的不准确性。应仔细分离25-bp的片段，以避免24-或23-bp片段的污染，其可能没有PAM在适当的位置。
用户可根据用途和实验室环境选择深度序列分析软件和序列分析软件（程序P，数据分析）。例如，深度测序也可以由Illumina HiSeq完成。

食谱

TE缓冲液（10mM Tris HCl [pH 8]，1mM Na 2 EDTA） 100 ml：
1 ml 1M Tris HCl（pH 8）
0.4ml 250mM Na 2 EDTA
98.6毫升MilliQ水
高压灭菌，然后在室温下储存

致谢

我非常感谢朱利亚·巴斯蒂尼亚洛（Gulia Bastianello）批评阅读手稿。这项研究没有得到任何公共，商业或非营利部门的资助机构的具体拨款。该方案来自荒川（2006）。

参考

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