材料和试剂

EndoFree Plasmid Kit（QIAGEN，目录号：12362）
快速绿FCF（Sigma-Aldrich，目录号：F7252）
无菌盐水（0.9％氯化钠）
70％乙醇
Katemine + Xylzaine混合物（参见配方）

设备

微量移液器（Borosilicate，长丝O.D.：1mm，I.D .: 0.78mm，10cm长）（Sutter Instruments，目录号：BF100-78-10）
微量移液器P-97/IVF（Sutter Instruments，Novato，CA）
电穿孔仪（ Electro-Square porator CUY21 ）（NEPA Gene）
铂板镊子型电极（Protech International，型号：CUY650-P5）
环形钳（Fine Science Tools，目录号：11101-09）
锯齿钳（Fine Science Tools，目录号：11000-12）
精细剪刀（Fine Science Tools，目录号：14060-09）
针架（Fine Science Tools，目录号：12003-15）
Silk Black Braided Suture（Ethicon，目录号：K871）
3"×3"无菌纱布（Dynarex，目录号：3353）
方形脉冲电穿孔仪CUY21（Nepagene，Japan）。需要一个脚踏板，因为在手术过程中，两只手都被分别握住动物和电极
口移液管（Sigma-Aldrich，目录号：A5177）
光纤灯尼康MKII或任何其他品牌）
用于异氟烷麻醉的蒸发器（Porter Instruments Company，型号：100-F）强烈建议使用异氟烷作为麻醉剂。如果不可用，腹膜内注射氯胺酮（80-100mg/kg）和赛拉嗪（5-10mg/kg）的混合物也将起作用。但避免对胚胎有毒的avertin

程序

制备用于DNA注射的微量移液管
1. 用Micropipette拉出器拉动硼硅化的微型地毯。推荐以下参数：压力，500; 热，800; 拉，30; 速度，40; 时间，这个程序应该生产一个长肩逐渐渐变的移液器。
2. 用距离移液管肩部约1.2厘米的镊子切下吸取的移液管。
3. 标记吸管的提示，用防水魔术标记，以澄清他们的结束。标记吸管的主体每5毫米长度防水魔术标记（1跨度与5毫米对应于5微升）。
DNA制备
1. 使用EndoFree质粒试剂盒纯化质粒。 DNA的最终浓度应高于1μg/μl^{-1。更高浓度的DNA产生更亮的荧光}
2. 向DNA溶液中加入1/10体积的1％快速绿色作为示踪剂（最终0.1％）
电穿孔
1. 设置电穿孔：对于E15胚胎：35 V，50 mSec开，950 mSec关，5脉冲。对于年龄较大或较大的动物，电压应相应降低或增加。我通常每天使用1-2伏增量。
2. 设置嘴移液器：插入一个微孔吸入嘴吸管。将约10μlDNA溶液吸入微量移液管
3. 麻醉一个定时怀孕的老鼠用异氟烷（或用i。p。注射katemine +赛拉嗪）。
4. 用异氟烷初次麻醉后，将小鼠放在手术台上腹部上方。然后将来自异氟醚蒸发器的面罩贴在鼠标鼻子上。将带有实验室磁带的腿绑在操作平台上。
5. 用70％乙醇洗腹部。使用一把小剃刀剃掉腹部的毛皮（可以从Walgreen购买）。用一块折叠的纱布覆盖腹部，在其中央有一个3厘米长的狭缝（图1）。
6. 用无菌盐水冲洗纱布。
7. 使用细剪在纵向切开皮肤约2厘米长在中线。然后在腹腔的肌肉中做出约1.5cm的切口。腹壁的中线（可以看作是一条细的白线）不应该被切割以良好愈合。
8. 用环镊子，通过捏胚胎之间的间隙（但不是胎盘或胚胎）仔细取出子宫。重要的是注意不要损伤胎盘或与子宫相连的血管。在整个手术中，你应该通过应用预热（37℃）的盐水保持子宫湿。
9. 用锯齿镊子轻轻握住子宫，仔细推动一个胚胎与环镊子到子宫壁。通过光纤的照射，子宫孔是透明的。端脑清晰可见。
10. 用一只手握住环镊子的胚胎，用另一只手握住嘴移液器。用微量移液管穿透新皮层2-3毫米，微量吸头位于侧脑室（图2）。
11. 注入1-3微升的DNA溶液到心室。如果正确靶向，侧脑室应填充DNA-快速绿色，并呈现新月形
12. 用注射过的胚胎沿着前后轴平行穿过子宫，用环形镊子，并将铂板镊子型电极穿过大脑，"+"电极在注射侧旁边。给胚胎输送电脉冲：35 V，50 mSec On，950 mSec Off，5脉冲。
13. 继续另一个胚胎。你可以将所有的胚胎注入窝里，除了最接近阴道的那个。避免这种情况有助于避免流产。
14. 小心地将胚胎放回腹腔。
15. 用温盐水填充空腔。重要的是尽力将胚胎放置到原始位置。用PBS填充腹部可以帮助胚胎滑回到它们的原始位置
16. 用缝合线关闭子宫壁的手术切口，然后缝合皮肤
17. 保持动物温度在37°C，直到从麻醉恢复

代表数据

图1.改编自Saito和Nakatsuji，2001，Dev Biol

图2.来自Saito和Nakatsuji，2001， Dev Biol

食谱

1％H 2 O中的快速绿色（过滤并在RT存储）
Katemine + Xylzaine混合物应在使用前立即进行：
组合：1ml氯胺酮（浓度100mg/ml）
0.5ml甲苯噻嗪（浓度为20mg/ml） 8.5ml无菌盐水或PBS
剂量：0.1mg/10mg体重。

致谢

该协议改编自Saito和Nakatsuji（2001），Ge等人（2009）和Mao等人（2010）。

参考文献

Ge，X.，Frank，C.L.，Calderon de Anda，F.and Tsai，L.H。（2010）。 Hook3与PCM1相互作用以调节近中心材料装配和神经发生的时间。 Neuron 65（2）：191-203。
Mao，Y.，Ge，X.，Frank，CL，Madison，JM，Koehler，AN，Doud，MK，Tassa，C.，Berry，EM，Soda，T.，Singh，KK，Biechele，，TL，Moon，RT，Haggarty，SJ和Tsai，LH（2009）。 Cell 136（6）：1017-1031。

Saito，T。和Nakatsuji，N。（2001）。使用体内电穿孔将高效基因转移到胚胎小鼠脑中。/a> Dev Biol 240（1）：237-246