材料和试剂

设备

程序

如前所述（Trotochaud等人，1999），使用或不使用0.1％Triton X-100制备花椰菜（芸苔）分生组织蛋白提取物。注意，在每300×g组织的提取缓冲液中加入1ml用于植物细胞提取物的蛋白酶抑制剂混合物。在使用前，将提取物在4℃以40,000×g离心30分钟。这是非常重要的使用新鲜的花椰菜。我们通常尝试从当地农场获得花椰菜。使用剃刀刀片"刮"花椰菜的头部收集分生组织
在转子上室温（RT）下用约400μl花椰菜蛋白提取物孵育约100μg纯化的GST-mCLV3蛋白（成熟的CLV3 protrein）2小时。
对于N-末端标记的片段（〜32-34kD）分离。
1. 结合蛋白混合物与谷胱甘肽琼脂糖4B
2. 用含有10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl（pH8.0）的缓冲液洗脱含有来自珠子的片段的N-末端GST。
3. 如果需要，使用Microcon YM-50离心过滤器在14,000×g，4℃浓缩蛋白洗脱30分钟，并在所需体积和缓冲液（例如0.1％TFA三氟乙酸酸/水），用于MS分析
对于C端未标记片段（〜2-4kD）分离。
1. 将主题蛋白质混合物通过Microcon YM-10离心过滤器在14,000×g，4℃下离心30分钟。
2. 收集流通级分用于完整的MS分析
3. 通过MS/MS分析（对照：仅花椰菜蛋白提取物; GST-CLV3与花椰菜提取缓冲液孵育）进一步表征感兴趣的峰。

食谱

致谢

该方案已经改编自以前的出版物，包括Ni和Clark（2006），Ni et al。（2011）和Trotochaud （1999）。

参考文献

Ni，J.and Clark，S.E。（2006）。 CLAVATA3 CLE域功能保守，充足性和蛋白水解加工的证据 em> Plant Physiol 140（2）：726-733。
Ni，J.，Guo，Y.，Jin，H.，Hartsell，J.and Clark，S.E。 CLE处理活动的表征。植物分子生物学 75（1-2）：67-75
Trotochaud，A.E.，Hao，T.，Wu，G.，Yang，Z.and Clark，S.E。（1999）。 CLAVATA1受体样激酶需要CLAVATA3将其装配成信号复合物，包括KAPP和Rho相关蛋白。植物细胞 11（3）：393-406