材料和试剂

移液器提示
10厘米细菌组织培养（TC）处理的培养皿（Corning，Falcon ^{®，目录号：353003）}
TC处理的6孔板（Corning，Costar ^{®，目录号：353502）}
15ml Falcon管（E& K Scientific Products，目录号：EK-4020）
50ml Falcon管（E& K Scientific Products，目录号：EK-4023）
细胞刮刀（SARSTEDT，目录号：83.1830）
0.45μm注射器过滤器（Corning，目录号：431225）
T-75烧瓶（Corning，Falcon ^®，目录号：353136）
T-125烧瓶（Corning，Falcon ^{®，目录号：353112）}
冷冻保养瓶（Corning，目录号：430659）
RAW264.7细胞（ATCC，目录号：TIB-71）
293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
hCas9质粒（Addgene，目录号：52962）
FuGene（Promega，目录号：E2311）
VSV-G（Addgene，目录号：8454）
pAdVAntage（Promega，目录号：E1711）
△VPR（Addgene;目录号：8455）
Genome-wide Mouse慢病毒CRISPR gRNA文库v1（Addgene，目录号：50947）
过滤的DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11995073）
过滤（0.2μm过滤器）热灭活（37℃30分钟）FBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，特异性）}
硫酸鱼精蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：P3369-10G），在4℃下保持8mg/ml的存储量
杀虫素氢氯化物（MP Biomedicals，目录号：02150477-25mg）在-20℃下保持10毫克/毫升的等分试样。
DMSO（Fisher Scientific，目录号：BP231-100）
来自阿尔伯格链霉菌的嘌呤霉素二氢胆碱（Sigma-Aldrich，目录号：P8833）
RAW264.7和293T组织培养基（参见食谱）
杀稻瘟素选择媒体（见配方）
嘌呤霉素选择培养基（见食谱）
组织培养冷冻介质（见食谱）

设备

移液器
荧光显微镜可以显示BFP
37℃的培养箱，5％CO 2
离心机

程序

制作表达hCas9的RAW264.7细胞
1. D0：在10ml DMEM + 10％FBS中处理10cm板的组织培养物（TC）中的板5×10 6个细胞，并在37℃下用5％CO 2孵育过夜， 2 。我们的目标是达到30-40％的汇合。
2. D1：在293T细胞中形成表达hCas9的逆转录病毒。
3. D2：
4. D3：收获病毒并转染RAW细胞
5. D4：将RAW264.7细胞吸出培养基，并加入新的37℃DMEM + 10％FBS培养基转导RAW细胞。
6. D5：将转导的RAW264.7细胞从6孔板转移到TC处理的10cm培养皿中。这种分裂应该在第二天产生理想的30％汇合抗生素选择。此时，以相同的汇合为10cm的非转导的RAW264.7细胞作为抗生素选择的阴性对照（每10cm皿约1×10 6个细胞）。
7. D6：抗生素选择
8. D7-8：
9. D8-9：
扩增CRISPR gRNA文库
1. 按照先前公布的协议（Koike-Yusa等人，2014年; https://media.addgene.org/data/67/85/9641c46c-8523-11e3-b6c5-000c298a5150.pdf ）。使用扩增文库的"板上培养"方法，因为"液体培养"方法可导致排除图书馆中的一些质粒（图1）。
2. 冷冻回收扩增的CRISPR gRNA质粒文库
  
  图1. Koike-Yusa等人的图形摘要（2014）gRNA文库的扩增方案
创建CRISPR gRNA慢病毒文库
1. 开始之前，请参阅注释5.
2. D0：在25ml DMEM + 10％FBS中每T-175的板1×10 6个/ml 293T细胞。
3. D1：创建CRISPR gRNA慢病毒文库。
4. D2：
5. D3：收获病毒并转染RAW264.7细胞
6. D4：板5×10 6在T-175烧瓶中的25ml 37℃DMEM + 10％FBS中的RAW264.7-hCas9表达细胞用于抗生素选择阴性对照。
7. D6：使用荧光显微镜和抗生素选择检查转染效率
8. D9：分离并扩增用CRISPR gRNA慢病毒文库转染的RAW264.7细胞
9. D13：用CRISPR gRNA慢病毒文库转染RAW264.7细胞并进行冷冻

数据分析

对于您的图书馆排序和分析图书馆或图书馆结果的覆盖范围，请参阅我们的原始出版物（Napier 等人，2016年）。

笔记

晚上，您可能会开始看到合胞体。合胞体是正在产生病毒的迹象。
逆转录病毒更容易感染有丝分裂细胞，因此通过在AM和PM中从同一个孔中收获两次，您将使捕获RAW264.7细胞分裂的机会增加一倍。
您可以将其余部分储存在4°C，以便再次感染多达7天。然而，冻结显着降低滴度
在我们手中，RAW264.7细胞的转导不会改变细胞系的免疫学特征，但是如果在该方案中使用另一种细胞系，则必须使用具有非编码序列的逆转录病毒控制来确保感兴趣的表型在转导后不改变
该方案已被293T细胞产生的慢病毒细胞转染效率标准化为30％。这种较低的转染效率用于降低发生在同一细胞的双重或三重转染事件的频率。您将在细胞中转染1,000倍的gRNA文库。对于该协议，有87,897个gRNA（Koike-Yusa等人，2014）;因此，我们转染（8800万RAW246.7细胞）x（30％）= 2.64亿RAW246.7细胞以保持1,000倍的覆盖率，转染效率为30％。

食谱

RAW264.7和293T组织培养基
37°C DMEM
10％FBS

杀稻瘟菌素选择媒体
37°C DMEM
10％FBS
10μg/ml杀稻瘟素

嘌呤霉素选择培养基
37°C DMEM
10％FBS
5μg/ml嘌呤霉素

组织培养冻结媒体
50％DMEM
40％FBS
10％DMSO

致谢

该研究得到了国家过敏和传染病研究所1F32AI115959-01（对BA Napier）和AI095396-05（DM Monack）和国防高级研究计划署（DARPA）的授权，授予DARPA-15-21-ThoR- FP-006（到DM Monack）。

参考

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