材料和试剂

阴影椎间盘切开步骤
1.微量移液器的无菌提示，1,000μl
2. 1.5 ml DNA低粘合管（Eppendorf，目录号：022431021）
施耐德昆虫培养基（Sigma-Aldrich，目录号：S0146）
胚胎收集步骤
1. 培养皿
2. 1.5ml DNA低结合（LoBind）管（Eppendorf，目录号：022431021）
3. 果蝇胚胎
4. SAF-INSTANT酵母（Lesaffre）
5. 液氮
6. 琼脂
7. 溶于水的10％Moldex（Methyl-4-羟基苯甲酸酯）（Sigma-Aldrich，目录号：W271004）
8. 中性红（Sigma-Aldrich，目录号：N4638）
9. 铺鸡蛋糕（见食谱）
染色质免疫沉淀方案
1. 1.5ml DNA低结合（LoBind）管（Eppendorf，目录号：022431021）
2. 15 ml无菌塑料管（Greiner Bio One International，目录号：188261）
3. 50ml无菌塑料管（Greiner Bio One International，目录号：227261）
4. 15ml聚苯乙烯Falcon管（Corning，目录号：352095）
5. 无菌过滤嘴10μl，200μl，1,000μl（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1121-2710，S1120-8810，S1122-1830）（详见附注1）
6. 无菌，DNA酶和RNA酶免费，DNA低结合过滤嘴10μl，200μl，1,000μl（Sorenson BioScience，目录号：35210,35240,35260）（详见附注1）
7. Qubit ^{®测定管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：Q32856）}}
8. LightCycler ^{®480多孔板96，白（Roche Molecular Systems，目录号：04729692001）}
9. LightCycler ^{® 480密封箔（Roche Molecular Systems，目录号：04729757001）}
10. 液氮
11. 20％十二烷基硫酸钠（SDS）（Biosolve，目录号：198123）
12. 高压灭菌1 M KCl溶液
13. 高压灭菌5 M NaCl溶液
14. 高压灭菌1 M MgCl 2 溶液
15. 无菌过滤的1M HEPES缓冲液pH 7.6（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
16. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
17. 将溶于去离子水的粉末（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）制备的1 M DL-二硫苏糖醇（DTT）
18. 1 M由粉末（Sigma-Aldrich，目录号：303410）制成的丁酸钠溶于去离子水中
19. 不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合片剂（Roche Molecular Systems，目录号：04693132001）
20. 16％甲醛溶液，不含甲醇（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：28906）}
21. 将2.5M甘氨酸溶于用一次性注射器过滤器（0.45μm）过滤的去离子水中（粉末（Sigma-Aldrich，目录号：G8898））（Pall，目录号：4422）
22. 0.5M EDTA pH8.0（Sigma-Aldrich，目录号：03690）
23. 溶解在去离子水中的粉末（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）制备的0.5M EGTA pH8.0
24. 1 M溶解在去离子水中的由粉末（Sigma-Aldrich，目录号：D5670）制备的脱氧胆酸钠
25. 20％N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液（Sigma-Aldrich，目录号：L7414）
26. 10毫克/毫升溶解在去离子水中的RNase A（Sigma-Aldrich，目录号：R6513）
27. UltraPure 苯酚：氯仿：异戊醇（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15593049）在文本中被称为苯酚 - 氯仿}
28. 3M醋酸钠，pH5.5（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM9740）}
29. 35 mg / ml糖原（MP-Biomedicals，目录号：11GLYCO001）
30. 乙醇绝对AnalaR NORMAPUR ^{®（VWR，目录号：20821.310）}
31. 琼脂糖粉（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）
32. 从50x溶液制备的1x TAE缓冲液（Biosolve，目录号：205023）
33. 高压灭菌Tris HCl pH 8.0
34. 溴化乙锭（Sigma-Aldrich，目录号：E1510）
35. 无脱氧核糖核酸酶，不经DEPC处理（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM9937）}
36. 尿素（MP Biomedicals，目录号：821519）
37. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
38. 溴苯酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
39. 100 bp DNA ladder（New England Biolabs，目录号：N3231S）
40. Qubit ^{® dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：Q32854）}}
41. Dynabeads ^{®用于免疫沉淀的蛋白A（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10001D）或Dynabeads用于免疫沉淀的蛋白G（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM ，目录号：10003D）（详见附注2）}}}
42. 20mg / ml蛋白酶K（Sigma-Aldrich，目录号：P2308）
43. 1μg/μl正常兔IgG（Cell Signaling Technology，目录号：2729）
44. 无菌过滤水（Sigma-Aldrich，目录号：W3500）
45. LightCycler ^{® 480 SYBR Green I Master（Roche Molecular Systems，目录号：04707516001）}
46. 10x胚胎缓冲液储备溶液（参见食谱）
47. 胚胎缓冲液（参见食谱）
48. 缓冲液A1（参见食谱）
49. 裂解缓冲液1（参见食谱）
50. 裂解缓冲液2（参见食谱）
51. 裂解缓冲液洗涤（参见食谱）
52. TE缓冲区
53. 低蓝色加载缓冲区（见配方）
54. 洗脱缓冲液1（参见食谱）
55. 洗脱缓冲液2（参见食谱）

设备

筛（孔<0.5mm）
微波
1升烧杯（Corning，PYREX ^{®，目录号：1003-1L）}
磁力搅拌器
笼（Dutscher Scientific，目录号：789092）
洗瓶
油漆刷（Carolina Biological Supply，目录号：173094）
校准检查移液器0-2μl，1-10μl，20-200μl，100-1,000μl
旋转轮，一个在寒冷的房间，另一个在室温下
立体显微镜
精细＃55镊子解剖（精细科学工具，目录号：11255-20）
Wheaton ^{TM Tenbroeck组织研磨机（WHEATON，目录号：357422）}
琼脂糖凝胶脚轮
振荡器（例如来自starlabgroup的轨道振荡器）（STARLAB INTERNATIONAL，型号：Orbital ^{TM 振动器，目录号：N2400-8030）}
冷离心机（4°C，能够达到至少14,000 x g）
冷超声波仪（我们推荐来自Diagenode的Bioruptor ^{®型号：Bioruptor ^{® Plus超声波设备，目录号：B01020001）}}
磁性架（Thermo Fisher Scientific，型号：DynaMag ^{TM -2磁铁，目录号：12321D）}
凝胶可视化系统（UV灯）
Qubit ^{®荧光计（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，型号：Qubit 3.0，目录号：Q33216）}}
LightCycler ^{®仪器II（Roche Molecular Systems，型号：LightCycler 480仪器II，目录号：05015278001）}

程序

生物样本的收集
注意：此步骤对于胚胎和图像光盘是不同的。
胚胎：
1. 使用微波炉的融合蛋产品介质（见食谱）。
2. 用培养皿中的15毫升填充培养皿。
3. 在放置培养基的同时，将100ml的水槽放入烧杯中，放在磁力搅拌器上
4. 逐渐加入50克酵母到烧杯中。当酵母混合物变得非常粘稠时，通过手动搅拌实现混合
5. 一旦产卵培养基变得固体，每个盘上撒上5-10ml酵母混合物（见图1）
  
  图1.用酵母混合物覆盖的铺蛋液
6. 将培养皿装配到笼子上（见图2），并让苍蝇放置鸡蛋，只要要获得足够数量的胚胎（见图3）。
  注意：见注3，了解所需的胚胎数量。
  
  图2.组装到包含成年苍蝇的笼子底部的培养皿
  
  图3.用果蝇胚胎（O / N产蛋）分层的培养皿
7. 通过用洗涤瓶喷洒1x胚胎缓冲液，收集筛子中的胚胎（见图4）。使用画笔来帮助。
  
  图4.筛子中的胚胎（O / N收集）
8. 通过将筛子放入胚胎缓冲液浴中（使用提示盒的盖子）将胚胎洗涤三次。
9. 收集胚胎与切200毫升的尖端并转移他们在一个Eppendorf管。
10. 删除尽可能多的缓冲区，并将它们存储在-80°C。
  
  图片：
  1. 在Schneider's培养基（SM）（Spratford和Kumar，2014）中分解成像圆盘，并将它们放入1.5ml LoBind Eppendorf管中，保持在冰上并含有1ml SM。
    注意：请参阅注释4了解所需的光盘数量。
  2. 解剖时间不应超过1小时。
  3. 离心2分钟（4℃，4,000xg），并除去上清液。想象的盘可以在液氮中快速冷冻并储存在-80°C几个月，允许多轮解剖以收集足够的物质。
将蛋白质与DNA交联
注意：在此步骤中，胚胎和成像光盘样品以相同的方式处理。
1. 如果样品已经冻结，在冰上解冻几分钟。
2. 重新悬挂组织，并将其汇集在最终体积为888μl的冰冷的A1缓冲液中
3. 将它们在室温（RT）下转移到2ml紧的Tenbroeck中
4. 固定：在Tenbroeck（终浓度为1.8％FA）中快速加入112μl16％甲醛（FA）。固定在室温下进行。
  注意：有关使用FA浓度的说明，请参见注5。
5. 通过在灰浆中缓慢地移动Tenbroeck的杵，将组织破碎5分钟。
6. 将破碎的组织转移回1.5 ml LoBind Eppendorf管。
7. 在RT上旋转轮：固定时间为15分钟。
8. 停止交联：加入160μl2.5M甘氨酸（最终350mM），放在旋转轮上5分钟，然后放在冰上。
  
  注意：除非另有说明，所有以下步骤均在冰面或4°C下进行。
9. 离心2分钟（4℃，2,000xg），弃去上清液。
10. 用1ml缓冲液A1洗涤（通过移液来破坏沉淀）。
11. 离心2分钟（4°C，2,000 x g）
12. 重复步骤B9和B10两次。
13. 用裂解缓冲液1洗涤一次，离心2分钟（4℃，2,000×g），并除去上清液。
通过超声处理染色质分离和碎裂
注意：这个步骤对于胚胎和想象的光盘样本是不同的。
胚胎：
1. 准备2ml 0.1％SDS裂解缓冲液2（10μl20％SDS +1,990μl裂解缓冲液2）。
2. 用（数量/ 1,000）×250μl新鲜制备的0.1％SDS裂解缓冲液2重悬沉淀物。
3. 在冰上孵育2小时，并将冰桶与样品放在振荡器（600rpm）中以避免SDS沉淀。
  注意：有关替代方法，请参见注释6。
4. 超声处理：在几个15ml聚苯乙烯Falcon管中裂解裂解物，以便每管获得1.5ml裂解物。
  注意：有关超声处理效率的注意事项，请参见附注7.
5. 设置Bioruptor超声波仪器如下：循环次数= 12，功率=高，ON = 30秒，OFF = 30秒。
6. 超声处理后，将所有管道放回原处。在此步骤中，样品可以在液氮中快速冷冻，并在-80℃保存数月。
图片：
1. 准备1ml 1％SDS裂解缓冲液2（50μl20％SDS +950μl裂解缓冲液2）。
2. 用（数量的圆盘/ 600）×150μl新鲜制备的1％SDS裂解缓冲液2重悬沉淀物。
3. 在冰上孵育2小时，并将冰桶与样品放在振荡器（600rpm）中以避免SDS沉淀。
  注意：有关替代方法，请参见注释6。
4. 超声处理：在几个1.5 ml LoBind管中裂解裂解液，以便每管获得150μl裂解物。
  注意：有关超声处理效率的注意事项，请参见附注7.
5. 设置Bioruptor超声波仪器如下：循环次数= 18，功率=高，ON = 30秒，OFF = 30秒。
6. 超声处理后，将所有管道放回原处。在此步骤中，样品可以在液氮中快速冷冻，并在-80℃保存数月。
超声波测试
注意：在此步骤中，胚胎和成像光盘样品以相同的方式进行处理。如果您的超声条件已经确定，您可以跳过此步骤。
1. 对于超声处理测试，在新鲜的1.5ml Lobind管中转移5-10μl裂解物（200ng DNA是足够的）。在超声处理试验中，将剩余的裂解物保持在4℃。
2. 用裂解缓冲液1将体积达100μl。
3. 加入2μl10 mg / ml核糖核酸酶A，并在65℃下以450rpm搅拌孵育6小时（至O / N）。
4. 加入100μl酚 - 氯仿，旋涡30秒
5. 离心10分钟（RT，最大速度）。
6. 将水相转移到新鲜的1.5ml Lobind管中，加入10μl3M NaAc（pH 5.5），2μl35mg / ml糖原和250μl100％EtOH。涡旋并在-20℃下孵育30分钟。
7. 离心20分钟（4℃，最大速度）
8. 在离心过程中，通过用0.75毫升1×TAE缓冲液溶解0.75克琼脂糖粉末制备1.5％琼脂糖凝胶。
9. 将琼脂糖溶液在微波炉中熔化，然后冷却5分钟，然后加入3μl溴化乙锭。
10. 将凝胶投入琼脂糖凝胶浇铸机，让其在室温下冷却。
11. 一旦离心20分钟，取出上清液，然后将其在室温下空气干燥10分钟
12. 将沉淀重悬于8μl无核酸酶的H 2 O 2中，加入2μl低蓝色加载缓冲液（详见配方）。
13. 在凝胶上沉积5μl100 bp DNA梯和10μl超声波测试。
14. 在135 V下运行凝胶20-25分钟，并使用紫外灯观察。高效超声处理的一个例子如图5所示注意：关于超声处理质量的重要性的注意事项，请参见注8。
  
  图5.理想的超声波凝胶。 1。 100bp梯;超声波测试体积DNA片段的大小范围为100〜300bp。
免疫沉淀
注意：这个步骤对于胚胎和想象的光盘样本是不同的。
胚胎：
1. 如果超声处理模式是足够的，将超声处理的裂解物离心5分钟（4℃，14,000×10 7 g）。如果超声处理不足，请以相同的设置超声染色质2个循环，重复超声处理。
2. 将上清液转移到新鲜管中（如果可能的话）将其转移到新管中
3. 使用Qubit dsDNA HS测定试剂盒按照制造商的说明书（1μl超声处理的裂解液应足够）定量DNA。
  注意：请参阅注9，了解有关IP的IP数量的建议。
4. 将染色质样品分成N份，每份含有250μl。 N = IP数量+ 2（一个模拟器和一个输入）。
5. 洗涤（样品数量+ 2）×15μl蛋白A或G Dynabeads。
  注意：请参见注10，了解如何清洗珠子，并参见注2，了解要使用的Dynabeads的类型（A或G）。
6. 预清洗：将15μl洗涤的蛋白A或G Dynabeads加入到染色质样品中，并在4°C的旋转轮上预清洁染色质2小时（至<0> O / N ）。
7. 将管放在磁性架中，并将预清除的染色质（上清液）转移到新鲜的1.5 ml LoBind管中。
8. 将含有输入管的管保存在4℃，直到步骤F13（DNA回收）。
9. 免疫沉淀：将抗体添加到IP管和Mock中;在4°C的旋转轮上孵育4 h。对于Mock，使用与用于知识产权的相同物种相同数量的正常IgG。
  注意：有关我们使用的兔正常IgG的目录号，请参阅材料和试剂。有关要使用的抗体数量（注11）以及可以执行哪些控件的详细信息，请参阅注释（注12,13和14）。
10. 孵育期间：洗涤（IPs + 1模拟物）×30μl蛋白A或G Dynabeads。
  注意：请参见注10，了解如何清洗珠子，并参见注2，了解要使用的Dynabeads的类型（A或G）。
11. 每个样品加入30μl蛋白A Dynabeads，并在4°C的旋转轮上孵育 O / N 。
图片：
1. 如果超声处理模式是足够的，将超声处理的裂解物离心5分钟（4℃，14,000×g）。如果超声处理不足，请以相同的设置将染色质超声5次，并重复超声处理。
2. 将上清液转移到新鲜的1.5 ml LoBind管中
3. 使用Qubit dsDNA HS测定试剂盒按照制造商的说明书（1μl超声处理的裂解液应足够）定量DNA。
  注意：请参阅注9，了解有关IP的IP数量的建议。
4. 将染色质样品分成N等分试样，每个样品含有100μl。 N = IP数量+ 2（一个模拟器和一个输入）。
5. 通过加入900μl裂解缓冲液2（不含SDS）稀释10倍，以达到0.1％SDS终浓度。最终体积为1 ml。
6. 洗涤（样品数量+ 2）×15μl蛋白A或G Dynabeads。
  注意：请参见注10，了解如何清洗珠子，并参见注2，了解要使用的Dynabeads的类型（A或G）。
7. 预清洗：将15μl洗涤的蛋白A或G Dynabeads加入到染色质样品中，并在4°C的旋转轮上预清洁染色质2小时（至<0> O / N ）。
8. 将管放在磁性架中，并将预清除的染色质（上清液）转移到新鲜的1.5 ml LoBind管中。
9. 将含有输入管的管保存在4℃，直到步骤F13（DNA回收）。
10. 免疫沉淀：将抗体添加到IP管和Mock中;在4°C的旋转轮上孵育4 h。对于Mock，使用与用于知识产权的相同物种相同数量的正常IgG。
  注意：有关我们使用的兔正常IgG的目录号，请参阅材料和试剂。有关要使用的抗体数量（注11）以及可以执行哪些控件的详细信息，请参阅注释（注12,13和14）。
11. 孵育期间：洗涤（IPs + 1模拟物）×30μl蛋白A或G Dynabeads。
  注意：请参见注10，了解如何清洗珠子，并参见注2，了解要使用的Dynabeads的类型（A或G）。
12. 每个样品加入30μl蛋白A Dynabeads，并在4°C的旋转轮上孵育 O / N 。
DNA恢复
注意：在此步骤中，以相同的方式处理胚胎和成像光盘样本。
1. 第二天将管放在磁性架上，弃上清
2. 在含有IP和Mock的管中放入1ml裂解缓冲液洗涤（保存在冰上），将其从磁性架上取出并将其放回冰上。
3. 通过移液均质，并在4°C的旋转轮上孵育5分钟。
4. 将管放在磁性架上，取出上清液。
5. 用裂解缓冲液洗涤重复步骤F2-F4（总共4次洗涤），用TE缓冲液（保存在冰上）两次。
6. 最后一次洗涤后，小心删除所有剩余的TE缓冲液。
7. 第一次洗脱：加入100μl洗脱缓冲液1，用移液管匀浆
8. 在剧烈摇晃（1,300rpm）下，将IP和模拟物在65℃下孵育15分钟。
9. 将样品放在磁性架上，并将上清液转移到新鲜的1.5 ml LoBind管中
10. 第二次洗脱：将150μl洗脱缓冲液2加入珠中并通过移液使其均质。
11. 在剧烈振荡（1,300rpm）下，在65℃下孵育15分钟
12. 将管放在磁性架上，并将两个洗脱液合并（最终体积250μl）
13. 去交联：在65°C，300 rpm下孵育所有样品6 h（至 O / N ）。不要忘记也采取在4°C保存的输入。
14. 第二天，每管加入3μl20 mg / ml蛋白酶K，并在56°C孵育2 h。
15. 加入1体积的苯酚 - 氯仿并涡旋30秒
16. 离心15分钟（RT，最大速度）。
17. 将水相转移到新鲜的1.5ml LoBind管中，并加入1/10体积的3M NaAc，pH 5.5（25μl），2μl35mg / ml糖原和2.5体积的100％EtOH（625μl）。 >
18. 降水：使样品涡旋，并在-20°C下孵育它们的O / N 。
通过PCR或测序鉴定因子相关DNA序列
注意：在此步骤中，以相同的方式处理胚胎和成像光盘样本。
1. 第二天，在4℃全速离心30分钟。
2. 弃去上清液，并用500μl冰冷的75％EtOH洗涤沉淀。
3. 离心10分钟（4℃，最大速度）。
4. 弃上清，空气干燥沉淀10分钟
5. 将沉淀物悬浮在所需体积的无核酸酶H 2 O（取决于下游应用，详见附注15），并将管置于37℃10分钟，450rpm。 br />
6. 对于ChIP-Seq，请参见注释16.
7. 对于qPCR，我们使用5μl的Master Mix，0.1μl的各引物（50pmol /μl），2.8μl的水和2μl的DNA样品。
8. 在PCR板上沉积之前，输入“稀释10倍”，以保持与其中一个IP的交叉点（Cp）相同的范围。
9. 请参阅数据分析部分了解如何分析结果。

数据分析

仔细选择oligo对的目标区域是非常重要的。我们建议使用至少两个阴性对照：一个已知不被研究的标记/蛋白质富集的位点，另一个位于感兴趣区域上游或下游约1-5kb的位点。还需要阳性对照区域。理想情况下，已知该区域被浓缩用于研究的标记/蛋白质
对每个寡核苷酸对执行至少两个技术重复。
一旦获得了交叉点（Cps），计算两次技术重复之间的平均值（见图6A）：
MEAN = 2 ^ - （平均值（Cp1，Cp2））返回线性刻度。
对于每个目标区域，计算 IP 和 MOCK 的输入的百分比（见图6A）：
输入IP的百分比= 2 ^ - （ MEAN IP ）/ 2 ^ - （ MEAN INPUT / 10 ）
输入MOCK的％= 2 ^ - （ MEAN MOCK ）/ 2 ^ - （ MEAN INPUT / 10 ）

图6.来自Eye-Antennal想象光盘的PSC ChlP。 A.显示复制1的不同计算步骤（列）的Excel表格; B.显示每个区域相对浓度的直方图，以百分比表示。不同的目标区域在x轴上表示，y轴对应于Input的％。 ' pgrp body'用作阴性对照区，位于pGRP-LE 基因的体内。 Antp（Antennapedia）是一个表征良好的PSC目标。与阴性对照组相比，dan （测试区域）显着丰富。与位于1kb下游（ + 1kb）的区域相比，eman dan 也显着丰富，表明共享相同高阶染色质环境的区域可以具有不同的局部组成，并提供进一步和理想的控制。
结果可以最终显示在条形图上（见图6B）。
图6B示出了从眼 - 触角成像盘（每个IP 500个光盘）一式三份进行的qChIP实验。在（Strutt和Paro，1997）中描述了PSC抗体，并且每IP使用10μl。以下PCR引物用于qPCR：
pgrp 正文：＆nbsp; → F：cctggtgaatgatagcttactctg
→ R：cttactcaaaaccgaagagatcg
Antp ：＆nbsp; → F：tggccgagtttatatcgaagcg
→ R：cggccaacttgtgttgttgttc
dan ：＆nbsp; → F：cattgtacatttggctgtcacc
→ R：gtcagttggtctgccttggtat
dan + 1 kb：＆nbsp; → F：ctctctagcttgacgcaccttt
→ R：aaactgtttagacccgacatgg
模拟器对应于背景级别，因此应始终低于IP。丰富的地区是与阴性对照区相比富集的地区，而不是在模拟中富集。

笔记

无菌，DNA酶和RNA酶游离，当尖端与溶解的染色质接触时，必须使用DNA低结合过滤嘴。否则，使用无菌过滤嘴。
蛋白A Dynabeads更适用于兔IgG，而蛋白G优先用于小鼠IgG。
对于16-18小时的胚胎，使用至少500只成年苍蝇，让他们下蛋2小时。从笼子中取出成年人，让胚胎发育16 h。每个IP（组蛋白标记和/或蛋白质），1,000个胚胎（约50毫克湿重）足够了
对于蛋白质，每IP需要400张想象的光盘（裂解后5微克的DNA）。对于组蛋白标记，200是足够的。
该协议适用于蛋白质的1.8％FA固定。而组蛋白标记1％FA通常就足够了
作为使用摇床进行裂解步骤的替代方法，可以每20分钟手动移液裂解物以避免SDS沉淀。
对于超声处理，4个参数是必不可少的：1）温度（浴必须保持在4℃），2）用于固定的FA的％（浓度越高，超声处理时间越长），3）进行超声处理的体积（使用Diagenode Bioruptor，我们建议不要在Eppendorf管[图像圆盘]中超声波超过150μl的裂解液，并在15 ml聚苯乙烯Falcon [胚胎]中超声波清洗），4）SDS的浓度裂解缓冲液（更多的SDS意味着更容易超声处理）。
超声处理的质量至关重要，因为它将决定ChIP实验的分辨率。平均大小为200-300 bp。
使用2-5μgDNA作为组蛋白标记，5-10μg用于蛋白质。然而，IP的质量也很大程度上取决于所用抗体的质量和数量
Dynabeads洗涤：
1. 在服用珠子之前，请仔细重新悬挂
2. 将含有珠子的管放在磁性架上并取出缓冲液。
3. 加入裂解缓冲液2的体积的3倍（例如，对于用3×75 =225μl裂解缓冲液2洗涤的75μl珠），将管从架上取出并通过移液冲洗珠进行均质化。 br />
4. 将含有珠粒的管放在磁性架上，弃去上清液，重复上一步骤。
5. 将含有珠粒的管放在磁性架上并丢弃缓冲液。将珠子重新悬浮在初始体积（[样品数量+ 2]×15μl或[样品数量+ 1]×30）中。
我们建议每IP使用5微克抗体，同样数量的Mock。
模拟（非特异性IgG）和输入是评估蛋白质在背景下的特异性和富集的良好对照。对于ChIP-Seq，只有输入是强制性的。
另一种可能的对照是使用特异性抗体来进行蛋白质/组蛋白标记，该标记不应该与您所感兴趣的蛋白质/组蛋白标记共定位。
理想情况下，应通过在K.O或K.D组织中进行ChIP评估抗体的特异性
对于ChIP-Seq，重悬于25μl无核酸酶的水中。对于qChIP，重新悬挂在所需的卷中，以重复的方式执行测量。
对于ChIP-Seq，使用1μlDNA样品使用Qubit dsDNA HS Assay Kit定量DNA。然后，根据需要使用2μlDNA样品溶解在无需核酸酶的水中，通过qPCR测试3-4个基因座（分析数据时，不要忘记考虑稀释度）。如果qPCR对照是令人满意的，样品可以用于文库的制备和测序。

食谱

铺鸡蛋（325毫升）
将8.75g在275ml水中混合的琼脂溶解在微波中。然后加入48ml醋和3.2ml 10％Moldex，加入50mg中性红色
10x胚胎缓冲液溶液
7％NaCl
0.5％Triton X-100

注意：以下描述的解决方案不应在4°C下储存超过1周。
胚胎缓冲液
用去离子水稀释10倍10倍的储备溶液
缓冲区A1
60 mM KCl
15 mM NaCl
4mM MgCl 2
15 mM HEPES
0.5％Triton X-100
0.5 mM DTT
10毫克丁酸钠在无菌过滤水中加入一片蛋白酶抑制剂鸡尾酒每50ml 50ml
裂解缓冲液1
140 mM NaCl
15 mM HEPES
1 mM EDTA
0.5 mM EGTA
1％Triton X-100
0.5 mM DTT
0.1％脱氧胆酸钠
10毫克丁酸钠无菌过滤水（Sigma-Aldrich）
加入一片蛋白酶抑制剂鸡尾酒每50ml 50ml 注意：裂解缓冲液1也将用于制备裂解缓冲液2和裂解缓冲液洗涤。
裂解缓冲液2
FRESH裂解缓冲液1中的0.5％N-月桂酰肌氨酸
裂解缓冲液洗涤
在FRESH裂解缓冲液1中的0.05％SDS
TE缓冲区
0.1 mM EDTA
无菌过滤水（Sigma-Aldrich）中的10mM Tris HCl pH8.0
低蓝色加载缓冲区
4 M尿素
50％蔗糖
1 mM EDTA
少量的溴酚蓝
注意：溴酚蓝以与超声处理的染色质相同的尺寸迁移，因此应尽可能多地稀释。
洗脱缓冲液1
10 mM EDTA
50 mM Tris HCl pH 8.0
无菌过滤水中的1％SDS
洗脱缓冲液2
0.1 mM EDTA
10 mM Tris HCl pH 8.0
0.67％SDS

致谢

我们感谢本协议所适用的文章的所有作者（Loubiere等人，2016年）。我们感谢FrédéricBienvenu（法国蒙彼利埃功能基因组研究所）的技术支持。我们感谢Filippo Ciabrelli的讨论和帮助，撰写本手稿。

参考

Loubiere，V.，Delest，A.，Thomas，A.，Bonev，B.，Schuettengruber，B.，Sati，S.，Martinez，AM and Cavalli，G。（2016）。＆lt; a class = -insertfile“href =”http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27643538“target =”_ blank“> PRC1蛋白质的协调重新调配可抑制果蝇发育过程中的肿瘤形成。 / a> Nat Genet 48（11）：1436-1442。
Spratford，CM和Kumar，JP（2014）。＆nbsp; 解剖和（91）：51792。
Strutt，H.和Paro，R。（1997）。黑腹果蝇的多梳组蛋白复合物在不同的靶基因上具有不同的组成。 Mol Cell Biol 17（12）：6773-6783