材料和试剂

无菌牙签
接种环（微细纹）（Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：SL1S）}
200-1,000微升移液管吸头（Corning，Axygen ^{®，目录号：T-1000-B）}
2-20μl移液器吸头（Corning，Axygen ^{®，目录号：T-200-Y）}
15ml锥形管（Greiner Bio One International，目录号：188271）
微孔过滤器，孔径22-25μm（EMD Millipore，目录号：475855）
20 ml注射器（BD，目录号：302830）
1.5ml微量离心管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-R）
手套
称重纸
玻璃棉（Sigma-Aldrich，目录号：18421）
280 ml塑料盒
幼虫
构巢曲霉菌株（TNO2A3菌株可以在真菌遗传学库中心商购获得，如＃A1149;ΔscAA和ΔgcsA突变体可由我们提供根据要求）
无菌去离子水
酵母提取物（BD，Bacto ^{TM ，目录号：212750）}
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
琼脂（BD，Bacto ^{TM ，目录号：214010）}
尿苷（Sigma-Aldrich，目录号：U3750）
尿嘧啶（Sigma-Aldrich，目录号：U0750）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：V000283）
硼酸（H 3 O 3 BO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：V000263）
四氢化锰（II）四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：221279）
硫酸铁（II）七水合物（FeSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：V000119）
二氯化钴（II）六水合物（CoCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：V000213）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：V000118）
钼酸铵四水合物（Sigma-Aldrich，目录号：V000122）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：V000114）
10 N氢氧化钠（NaOH）溶液
乙醇
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：V000106）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：V000317）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：V000225）
氯化氢（HCl）
蜂蜜（本地超市）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：V000123）
牛奶（当地超市）
小麦胚芽（本地超市）
小麦粉（本地超市）
麦麸（本地超市）
完整的媒体（YUU媒体）为构建成功者（见配方）
曲霉菌微量元素解决方案（见食谱）
70％乙醇溶液（见食谱）
PBS缓冲液（参见食谱）
设备
1. 100×10mm玻璃培养皿（Corning，PYREX ^{®，目录号：3160-100）}
2. 高压釜（Prismatec，型号：CS-18）
3. 层流柜（TROX Technik，型号：TLF-A1）
4. 250毫升烧杯（Roni Alzi，目录号：2-570）
5. 钝头镊子（EMD Millipore，目录号：XX6200006P）
6. 本生灯/打火机
7. 血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：3500）
8. 具有100x物镜的光学显微镜（美国光学公司）
9. 10μlHamilton 700系列胶结注射器（Hamilton，目录号：80300）
10. 分析天平（丹佛仪器，型号：XL-410，目录号：8515.1）
11. Spatula（Sigma-Aldrich，目录号：Z282774）
12. 量筒（Roni Alzi，目录号：2-950）
13. 玻璃瓶（康宁，PYREX ^{®，目录号：1395-1L）}
14. 手动可调吸管（200-1,000μl，Pipetman P1000）（Gilson，目录号：F123602）
15. 手动可调移液管（2-20μl，Pipetman P20）（Gilson，目录号：F123600）
16. 恒温培养箱（Fanem ^{®，型号：515）
  软件
  GraphPad Prism 7.0程序（GraphPad Software; https://www.graphpad.com/）程序
  真菌生长和分生孢子分离制备用于构巢曲霉的培养基（固体YUU培养基）生长并通过在121℃下高压灭菌20分钟进行热灭菌。在室温下冷却介质，直至接触愉快。
  
  将大约15ml的熔融培养基转移到无菌培养皿中。让琼脂板在室温下固化并风干20分钟注意：从本步骤到步骤B的最后，建议在层流柜中工作。
  
  从储存培养物（通常储存在含有固体培养基的斜培养管或培养皿中）中，使用无菌接种环或无菌牙签挑取少量真菌菌丝体。通过轻轻地来回传送环/牙签内容到固体YUU介质（在步骤A2中制备）。确保菌丝体均匀分布在整个板上，而不是进行条纹电镀程序。将培养物在37℃孵育2天或直到菌落生长。
  
  将1ml PBS缓冲液转移到A的表面。构建体培养在固体YUU培养基中生长（在步骤A3之后）。使用吸头，悬浮真菌细胞并将悬浮液转移到无菌的15毫升锥形管中。要获得足够的分生孢子，用新鲜PBS缓冲液重复此步骤至少5次，将悬浮液体积增加至≥5ml。
  
  用约200ml 70％乙醇溶液填充250ml烧杯。将镊子浸入乙醇溶液中，并在本生灯或打火机中小心地点燃。重复此步骤3 x，并在室温下冷却镊子2-3分钟。
  
  使用火焰镊子，将Miracloth过滤器或少量玻璃棉插入无菌20ml注射器的末端，并隔离A。通过过滤真菌悬浮液构成分生孢子。在新的无菌的15毫升锥形管中收集滤液。
  注意：视频1（曲霉生长和分生孢子分离）中显示了步骤A3-A6。＆nbsp;
  
  将10μl的分生孢子悬浮液转移到血细胞计数器中，并在光学显微镜的100倍物镜下计数A的数目。构巢体分生孢子。可以通过细胞总数×10,000 /计数方格数来估计分生孢子/ ml的浓度。
  注意：分生孢子应均匀分布在整个血细胞计数器中，悬浮液应足够稀释，以使细胞在网格上不重叠。
  
  真菌悬浮液应含有至少10分/分，因此使用的真菌悬浮液体积≤10μl。由于真菌悬浮液将注入幼虫体腔（如方法B所述），所以需要保持G.mellonella血淋巴的体积几乎恒定。如果获得的分生孢子浓度低于分生孢子/ ml的10分钟，则收获更多的构巢曲霉菌丝体（在步骤A4中描述），并重复过滤和点数。
  
  使用10 ^{6 A。结核分枝杆菌分生孢子对每只幼虫感染。将实验组中含有10 sup 6分生孢子x的分生孢子体积转移到新的1.5ml微量离心管中。保留等量的PBS给对照组。}
  
  注射构巢曲霉分生孢子中的分枝杆菌幼虫（Galleria mellonella）幼虫在昆虫蛹后饲养的成年蛾产卵后，获得。ella on。。昆虫应保持在塑料盒内，盖子上有小孔。为幼虫提供足够的人工饮食（），以便能够在饮食中挖掘他们的隧道（图1A和1B）。时代的发展（如图1C所示）应在21°C和黑暗中20-30天后发生
  
  图1.维护和开发G。 mellonella instars包括在含有自由口头人工饮食的充气塑料盒中孵育
  
  使用手套避免细菌污染和钝头镊子，手动选择10-20健康的G。来自具有相似尺寸（15-20mm）的最后一龄的幼虫，并且每个实验组的体重（约0.2g）。将最多10只幼虫放入无菌的100 x 10毫米培养皿中，无任何食物。
  注意：乳白色的昆虫，不显示任何灰色色素沉着和对镊子的触感，可以被定义为健康。灰色幼虫应丢弃。
  
  为实验条件和两个不同的对照组提供足够的幼虫。第一对照组可以包括用PBS缓冲液接种的幼虫，以监测由身体损伤引起的死亡。第二个对照组的昆虫不应该接受任何注射。
  
  通过吸取和丢弃70％乙醇溶液清洗10μlHamilton注射器。重复此过程至少3次。
  
  通过用室温无菌水洗涤注射器去除残留的乙醇。
  
  使用汉密尔顿注射器，吸出10μl真菌悬浮液，其中含有10μg/ ml的真菌悬浮液。构巢体分生孢子（在步骤A8中获得）。
  
  轻轻一点，选一个。 mellonella 幼虫用一只手牢牢握住它的背部，使用你的索引和拇指（图2）。
  
  图2.处理 G。 mellonella 幼虫为 A。 nidulans 感染
  
  小心地将哈密尔顿注射器的针插入幼体最后一个左前腿，并缓慢注射相当于10 ^{6 的体积。构巢体分生孢子在昆虫血淋巴中（图3）注意：避免使用太多的力量不刺穿幼虫并泄漏血淋巴。在这种情况下，请选择另一只幼虫。
  
  步骤B3-B7显示在视频2（注入A.mellonella幼虫中的构巢曲霉分生孢子中）
  
  图3. G的接种。 mellonella 通过注射真菌悬浮液在幼虫最后一个左前腿}
  将每个实验组的幼虫置于新的无菌培养皿中。在操作所有幼虫后，在28°C的黑暗中孵育。
  注意：幼虫也可以在37℃下孵育以模拟人体体温。
  
  感染24小时后，用钝头镊子轻轻触摸幼虫以评估存活。活着的幼虫（如图4A所示）应该快速反应，而没有与灰色/深色素沉着相关的运动表征死亡的幼虫（存在于4B中）。在每个实验组中每24小时记录一次活的和死亡的幼虫数量。约10天后，幼虫变成蛹。
  注意：实验中使用的所有动物的处理应在含有幼虫的培养皿的高压灭菌/去污后进行。
  
  这个步骤显示在视频3（幼虫生存分析）中
  
  图4. A后的幼虫生存分析。构巢体感染。活组织（图A）显示出乳白色色素沉着，并显示刺激下的运动反应。死亡时期表现出灰色/深色色素沉着，无反应。
  
  数据分析
  G的数据分析。使用GraphPad Prism 7.0的mellonella 生存。打开GraphPad Prism 7.0作为新项目。可以在线获得该软件的免费试用版（ https://www.graphpad.com/ < / a>）。
  
  在“新建表和图表”窗口中，选择“生存”表，其中每一行列出主体的生存或审查时间（图5）。
  
  图5. GraphPad Prism初始菜单中的“生存表”选择
  
  在“数据表”中记录实验数据，通过在x轴上插入实验的时间测量（天），并在y轴上插入每个实验组每天的死亡幼虫数量。
  注意：如果在给定的时间点没有幼虫死亡，则不需要在此时间内添加数字“0”。只记录幼虫死亡的天数/小时，为每只死亡动物插入数字“1”。如果该组中多于一只的动物在一个时间点中死亡，请在随后的一天重复同一天，并根据需要插入“1”。在下面所示的数据表（图6）中，没有包括第7,8,9天，因为没有观察到幼虫死亡。
  
  图6.表填写生存数据表中的实验数据
  
  在实验的最后一个时间点，对各组中的每个活着的幼虫进行0分。如果该组中有多只动物仍然存活，请在随后的一行重复相同的日/小时，并根据需要插入“0”（图7）。
  
  图7.在实验结束之前注册每个活的幼虫
  
  GraphPad棱镜通过使用Kaplan-Meier生存曲线自动分析统计学显着性。在同一个项目中打开“结果表”，以检查统计学意义（图8）。
  
  图8.显示统计学意义分析的结果表
  
  GraphPad Prism还自动创建数据图，可以轻松编辑（图9）
  
  图9. GraphPad Prism创建的生存图的图示
  
  对于项目演示或稿件提交，数据图可以以多种格式进行编辑和导出。在项目窗口中，选择“导出”文件归属。
  
  食谱
  完整的媒体（YUU媒体）为 A。构建者增长
  0.5％酵母提取物
  2％葡萄糖
  2％琼脂
  0.1％微量元素溶液
  5 mM尿苷
  10 mM尿嘧啶在天平上放置称重纸，称重。使用刮铲，转移所需质量的每种试剂
  将琼脂，尿苷和尿嘧啶粉末直接放入玻璃容器中，培养基将被高压灭菌
  用去离子水溶解酵母提取物，葡萄糖和微量元素溶液至最终体积的3/4
  使用量筒，完成水至最终体积，并将该溶液转移到含有琼脂，尿苷和尿嘧啶的玻璃瓶中。通过在121℃高压灭菌20分钟进行热灭菌
  注意：确保培养基的总体积小于玻璃容器容量的2/3，以避免在高压灭菌过程中溢出。
  
  曲霉菌
  的微量元素溶液 75毫升七水硫酸锌七水合物 180 mM硼酸
  25mM氯化锰（II）四水合物
  18 mM硫酸铁（II）七水合物
  6mM氯化钴（II）六水合物
  6 mM硫酸铜（II）五水合物
  1mM钼酸铵四水合物
  140mM乙二胺四乙酸在分析天平中称量每种试剂。按照上述顺序将粉末溶解在最终体积的1/8中，用去离子水进行
  将溶液加热至100°C，然后将其冷却至60°C
  用10 N氢氧化钠溶液调节pH至6.5-6.8
  将溶液冷却至室温，然后加入去离子水至最终体积
  
  70％乙醇溶液
  每100ml含有稀释在30ml蒸馏水中的70ml乙醇
  PBS缓冲液（根据Sambrook等人，2005）
  137 mM氯化钠
  2.7 mM氯化钾
  10 mM磷酸氢二钠
  1.8mM磷酸二氢钾称取试剂并用去离子水将其溶解至最终体积的3/4
  用氯化氢调节pH值为7.4，然后加入去离子水至总体积
  将溶液分成较小的等分试样，并通过高压灭菌消毒20分钟
  
  120克蜂蜜
  120克甘油
  200克牛奶
  60克酵母提取物 100克小麦胚芽
  100克小麦面粉
  120克麦麸使用分析天平，称量每种成分。混合人造饮食成分，并在121℃高压灭菌20分钟进行热灭菌
  
  致谢
  这项工作的资金来源是来自国家科技促进委员会（CNPq），安巴卢基金会，里约热内卢（FAPERJ），巴塞罗那高等教育协调中心（CAPES）。该协议是对Fernandes等人，2016年的使用方法的详细描述。
  参考
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  Fernandes，CM，de Castro，PA，Singh，A.，Fonseca，FL，Pereira，MD，Vila，TV，Atella，GC，Rozental，S.，Savoldi，M.，Del Poeta，M.，Goldman，GH和Kurtenbach，E.（2016）。功能表征构巢曲霉葡萄糖神经酰胺途径揭示了LCBΔ8-去饱和和C9-甲基化与丝状生长，脂筏定位和Psd1防御素活性相关。分子微生物3）：488-505。
  
  Li，DD，Deng，L.，Hu，GH，Zhao，LX，Hu，DD，Jiang，YY and Wang，Y。（2013）。使用环孢菌素 - 白色念珠菌感染模型评估抗真菌药物。 Bull 36（9）：1482-1487。
  
  Mylonakis，E.，Moreno，R.，El Khoury，JB，Idnurm，A.，Heitman，J.，Calderwood，SB，Ausubel，FM和Diener，A.（2005）。＆lt; a class = insertfile“href =”http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15972469“target =”_ blank“> 作为模型系统研究新型隐球酵母< / em>发病机制。感染免疫 73（7）：3842-3850。
  
  Sambrook，J.，Fristch，EF和Maniatis，T。（1989）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.cell.com/cell/abstract/0092-8674(90 ）90210-6“target =”_ blank“>分子克隆：实验室手册。（2 ^{nd edition）}冷泉港实验室出版社。}