材料和试剂

二氯甲烷（DCM）
二甲基甲酰胺（DMF）（Fisher Science，目录号：D119-4）
三氟乙酸（TFA）（ACRO，目录号：13972）
噻苯甲醚（TIS）（Sigma-Aldrich， 233781）
乙二硫醇（EDT）（TCI，目录号：E0032）
2-（1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四氢呋喃六氟磷酸盐（HBTU）（Anaspec，目录号：AS-21001）
N，N - 二异丙基乙胺（DIEA）（Santa Cruz Biotech，目录号：sc-215490）
哌啶（生物技术级，≥99.5％）（Sigma-Aldrich，目录号：571261）
二硫苏糖醇（DTT）
吡啶
氰化钾
茚三酮
Fmoc保护的氨基酸：
Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Glu（OtBu）-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys（Boc）-OH，Fmoc-Arg（Pbf）-OH，Fmoc-Asn ）-OH，Fmoc-Ser（tBu）-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-His（Trt）-OH，Fmoc-Gln（Trt）-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc -Thr（tBu）-OH，Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Asp（OtBu）-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Cys（Trt）-OH，Fmoc-Tyr（tBu）-OH，Fmoc-Trp （Boc）-OH
Rink酰胺树脂（0.66mmol/g）（AAPPTec，目录号：RRZ001或等同物）
C-18柱（Vydac，目录号：218TP510或等价物）所有试剂均为ACS级或合成级
无水乙醚

设备

肽合成仪CS-Bio 336x或等同物
分析天平
旋转桶eppendorf离心机或等同物
高效液相色谱（HPLC）
反应容器（SKU：PS-G002）
液相色谱 - 质谱仪

程序

树脂制备
1. 将303mg Rink-Amide树脂（0.20mmol当量）与过滤器一起放入反应容器中，并将上下出口分别连接到溶剂管线和废液管。
2. 向树脂中加入8.0ml DMF（洗涤步骤），轻轻搅拌5分钟，然后通过氮气压力（4-8psi）除去溶剂。重复3次。
脱保护/偶联循环
1. 加入8.0ml 20％哌啶/DMF（体积/体积），轻轻搅拌1分钟（第一次Fmoc除去步骤），然后通过氮气压力除去溶剂。
2. 加入8.0ml 20％哌啶/DMF（体积/体积），轻轻搅拌10分钟（第二次Fmoc去除步骤），然后通过氮气压力除去溶剂。
3. 加入8.0ml DMF（洗涤步骤1），摇动30秒，然后通过氮气压力除去溶剂
4. 加入8.0ml DMF（洗涤步骤2），摇动5分钟，并通过氮气压力除去溶剂
5. 重复步骤4四次。
6. 将1.0mmol Fmoc保护的氨基酸和HBTU（341.37mg，0.9mmol）溶于8.0ml DMF中。用氮气鼓泡混合30秒
7. 加入2.0mmol DIEA（1M，2ml），通入氮气30秒，并等待5分钟。将混合物加入树脂中。摇动1小时。然后通过氮气压滤除去溶剂
8. （关键步骤：由于一些树脂的脆性，当进行手工合成时，间歇搅拌优于连续搅拌，以便使小粒径树脂中的树脂碎裂最小化，这可导致在过滤期间的困难。作为替代，连续可以施加轻微振荡或通过反应容器的氮气鼓泡）
9. 重复步骤6和7进行双重耦合（可选）。
10. 加入8.0ml DMF（洗涤步骤），搅拌30秒，并通过氮气压滤除去溶剂
11. 重复步骤10三次。
12. 对于根据肽序列的每个后续氨基酸，使用上述Fmoc-氨基酸衍生物重复从步骤3开始到步骤12的循环。
  关键步骤：可以在每个循环通过使用微切割测试（参见下文）跟踪合成的进展。为了加快装配，可以进行单联接而不是双联接）重复耦合步骤的要求可以从Kaiser测试的结果（见下文）得出暂停点：当N末端氨基被保护时，合成原则上可以在每个偶联循环结束时中断。为了避免在DMF中储存期间Fmoc基团的不期望的去除，用DCM洗涤肽树脂5次，并使其在室温（18-22℃）下干燥。关闭注射器及其柱塞和帽，并存储在4°C。在恢复合成之前，让样品达到室温，并按照步骤2所述使干燥的树脂溶胀。
去除N-末端Fmoc基团并干燥肽树脂
1. 加入8.0ml 20％哌啶/DMF（体积/体积），轻轻搅拌1分钟（第一次Fmoc除去步骤），然后通过氮气压滤除去溶剂。
2. 加入8.0ml 20％哌啶/DMF（体积/体积），轻轻搅拌10分钟（第二次Fmoc除去步骤），然后通过氮气压滤除去溶剂。
3. 加入8.0ml DMF（洗涤步骤1），搅拌30秒，通过真空过滤除去溶剂
4. 加入8.0ml DMF（洗涤步骤2），搅拌5分钟，通过氮气压滤除去溶剂
5. 用DMF重复步骤5四次
6. 在玻璃过滤器中用DCM洗涤树脂四次。
7. 风干肽树脂。
肽切割和纯化（手动）
1. 通过在TFA/TIS/EDT/H 2 O（94:2:2:2）的混合物中孵育3小时进行肽裂解和去保护。
2. 过滤混合物，溶液中的肽用冰冷的无水乙醚沉淀，并在eppendorf摇摆桶中以1,000rcf的速度离心。将所得肽用冰冷无水乙醚洗涤四次，干燥，并溶于合适的缓冲液或溶剂中（如果存在半胱氨酸，则加入1mM DTT）。
3. 在C-18柱上通过RP-HPLC纯化肽。收集级分并冻干。通过ESI-MS表征目标产物，并准备用于反应的下一步骤

代表数据

图1.用该方案合成的肽的代表性HPLC色谱。保留时间为11.68分钟的峰是产物峰。

补充

凯撒测试
Kaiser试验是游离伯氨基存在或不存在的定性试验，并且它可以是关于偶联步骤的完整性的有用指示。该测试基于茚三酮与伯胺的反应，其产生特征性深蓝色。该测试需要最少量的分析物，并在几分钟内完成。
1. 试剂
  1. 0.5g茚三酮在10ml乙醇（EtOH）中的溶液
  2. 0.4ml 0.001M氰化钾（KCN）在20ml吡啶中的溶液
2. 程序
  1. 将几个树脂珠转移到小玻璃管或Eppendorf管中，用乙醇洗涤几次
  2. 加入100毫升上述每种溶液（见本框中的试剂）。
  3. 充分混合并将管置于预热的烘箱（115℃）中5分钟。浅绿色或无颜色为负。深蓝色或紫色为正。
    关键步骤为减少假阴性结果的发生率，建议进行平行阳性对照。该测试不适用于N-末端Pro残基（仲胺）和N-烷基氨基酸。当应用于聚合序列时，该测试可能给出假阴性结果
微裂纹
当Fmoc去除数据显示异常时，在执行需要使用特别昂贵的材料的步骤之前，或在关键步骤之后，并且通常在组装较长序列时，切割和分析少量中间产物可能是有用的。
1. 程序
  1. 将含有B1-2mg干燥肽树脂的样品转移到小注射器（2ml）中
  2. 向干燥的肽树脂中加入300ml裂解混合物（三氟乙酸/H 2 O /苯酚/三异丙基硅烷8.5/0.5/0.5/0.5），缓慢搅拌30秒，并等待3小时在其间轻轻搅拌）。
  3. 将溶液收集在小的HPLC小瓶中，用400ml乙腈/水1/1稀释并混合
  4. 在这一点上，可以在分析HPLC系统（注射20ml）和/或进一步稀释（1/10）注射（2ml）在液相色谱 - 质谱仪中分析溶液。

食谱

氨基酸试剂瓶
1.0mmol Fmoc氨基酸/0.2mmol等价树脂
0.9mmol HBTU/0.2mmol等量树脂
肽裂解混合物（对于200mg〜300mg干肽树脂，5ml）
4.7ml TFA 0.1 ml EDT
0.1 ml TIS
0.1 ml水

致谢

该协议是从以前的工作（Coin等人（2007）; Miao等人（2011）; Ren等人， >（2010））。这项工作部分地由加利福尼亚乳腺癌研究计划14IB-0091和SNM试验研究授权（ZC）支持。

参考文献

Coin，I.，Beyermann，M。和Bienert，M。（2007）。固相肽合成：从标准程序到难序列的合成。 em> Nat Protoc 2（12）：3247-3256。
M，Z.，Ren，G.，Jiang，L.，Liu，H.，Webster，JM，Zhang，R.，Namavari，M.，Gambhir，SS，Syud，F.and Cheng，。用于HER2阳性肿瘤PET成像的新型18F-标记的双螺旋支架蛋白。 a> Eur J Nucl Med Mol Imaging 38（11）：1977-1984。
Ren，G.，Liu，S.，Liu，H.，Miao，Z.and Cheng，Z.（2010）。。