材料和试剂

RNA和DNA提取
1. 移液器提示
2. TissueRuptor一次性探针（QIAGEN，目录号：990890）
3. 新鲜冷冻组织切片（30-50ng）
4. 消毒剂消毒剂（Fisher Scientific，目录号：04-355-32）
5. AllPrep DNA/RNA Mini Kit（QIAGEN，目录号：80204）
6. RNeasy MinElute清理套件（QIAGEN，目录号：74204）
7. Qubit 2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：Q32857）}
8. 纯乙醇（200分子生物学级）（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
9. Qubit ^® dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：Q32854）}
10. Qubit ^® RNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：Q32852）}
cDNA合成
1. 0.2 ml PCR 8管FLEX-FREE条，附有透明平盖，天然（USA Scientific，目录号：1402-4700）
2. SuperScript III第一链合成系统（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：18080051）。 SuperScript ^® III第一级合成系统提供以下功能：
  Oligo（dT）<20>（50μM），50μl
  
  随机六聚体（50ng /μl），250μl
  
  10x RT缓冲液，1 ml
  
  0.1 M DTT，250μl
  
  25mM氯化镁（MgCl 2/2），500μl
  
  10mM dNTP混合物，250μl
  
  SuperScript ^® III RT（200 U /μl），50μl
  
  RNase-OUT ^{TM（40U /μl），100μl}
  电子。大肠杆菌核糖核酸酶H（2U /μl），50μl
  
  DEPC处理水，1.2 ml
  
  总HeLa RNA（10 ng /μl），20μl
  
  感应控制引物（10μM），25μl
  
  反义对照引物（10μM），25μl}
gp120 和
的单基因组测序
1. 24个PCR孔
2. 移液器提示
3. TempPlate半裙式聚丙烯0.2 ml 96孔PCR板（USA Scientific，目录号：1402-9220）
4. Posi-Click 1.7ml微量离心管，1.7 ml自然色（Denville Scientific，目录号：C2170）
5. 分子生物学级无菌纯化水（RNase，DNase，不含蛋白酶）
6. EB缓冲液（QIAGEN，目录号：19086）
7. 蓝色PCR SuperMix（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：12580023）}
8. 琼脂糖（Fisher Scientific，目录号：BP160-500）
9. 溴化乙锭（Fisher Scientific，目录号：BP102-1）
10. Tris-base（Sigma-Aldrich，目录号：T1378）
11. 乙酸，冰川（Fisher Scientific，目录号：A38-212）
12. 乙二胺四乙酸，EDTA，0.5M溶液/pH 8.0（Fisher Scientific，目录号：BP2482-500）
13. Milli-Q质量水（RNase，DNase free water [dH <2> O]）
14. 底漆列于表1
  
  表1.引物
15. 50x TAE储备溶液（见配方）
16. 1x TAE缓冲液（参见食谱）

设备

TissueRupter转子 - 定子匀浆器（QIAGEN，型号：TissueRupper，目录号：9001271）
Matrix多通道电子移液器（范围：2-125μl; 12通道）（Fisher Scientific，目录号：14-387-117）*
Matrix多通道电子移液器（范围：1-30μl; 12通道）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-387-137）*
Matrix多通道电子移液器（范围：2-125μl; 12通道）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-387-138）*
Eppendorf Repeater ^TM流式电子移液器（Eppendorf，目录号：4987000118）
Eppendorf Research ^TM Plus可调量移液管：0.1-2.5μl，2-20μl，20-200μl，100-1,000μl（Eppendorf，目录号：022575442）
胶带（QIAGEN，目录号：19570）
Sub-Cell ^{TM 192型电泳系统（Bio-Rad Laboratories，型号：192型，目录号：1704507）}
51-Well comb（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704529）
梳子架（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704525）
UV透明凝胶托盘（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704524）
192型凝胶脚轮（Bio-Rad Laboratories，型号：型号192，目录号：1704517）
离心机5424，非冷藏，带转子FA-45-24-11，键盘，230 V/50-60 Hz（Eppendorf，型号：5424，目录号：5424000010）
Isotemp ^{TM数字干浴培养箱（Fisher Scientific，目录号：11-718-2Q）*}
T100 ^{TM热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：T100 ^{TM，目录号：1861096）}}
DNA寡核苷酸得自Invitrogen
Applied Biosystems 3730xl DNA分析仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{，型号：3730 DNA分析仪，目录号：3730XL）}

注意：这些产品已经停产。

软件

Geneious R7软件包（Biomatters http://www.geneious.com ）
MEGA5

程序

RNA和DNA提取
1. 使用ELIMINase去污剂前后彻底清洁工作台面和设备。
  注意：应使用过滤的吸管头进行RNA和DNA提取，cDNA合成和第一轮PCR设置，并且必须在具有单独的空气处理和实验室设备的无限制扩增子的空间中进行，其中没有扩增允许PCR产物或重组克隆质粒。如果没有这样的房间可用，在装有单独的空气处理机构的细胞生物级洁净罩中进行放大前的步骤。
2. 使用AllPrep DNA/RNA Mini Kit按照制造商的指南，从每个组织切片（30-50ng）分别并同时分离总RNA和基因组DNA。在RNA分离的最后一步中进行使用无RNA酶的水的两个最终的50μl洗脱液，总计最终体积为100μl。
3. 在使用TissueRupter转子 - 定子匀浆器提取之前，将组织均匀化，每个样品都装有新鲜的无菌一次性探头。
4. 根据制造商的说明书，使用RNeasy MinElute Cleanup Kit将100μl终体积的RNA浓缩。使用20μl无RNase的水的单次最终洗脱。
5. 使用Qubit 2.0荧光计和Qubit RNA HS测定试剂盒或Qubit dsDNA HS测定试剂盒在适当的情况下，进行所得RNA和DNA的定量以确定提取方案和浓度的成功。未检测到DNA或RNA，或对于RNA或DNA，产量低于1 ng /μl，表明提取失败，应重复提取，直到检测到超过1 ng /μl的RNA和DNA。 >
cDNA合成
1. 根据制造商的建议，使用所提供的寡核苷酸（dT）二级引物，使用SuperScript III型第一链合成系统立即从每个样品的RNA产生cDNA。，详细如下，以增加产品长度。
2. 在每个样品的两个相同的反应中，将8μlRNA与脱氧核苷三磷酸（0.5mM [各]）和5μM寡聚（dT）<20>在65℃孵育5分钟，然后迅速冷却至4°C。
  注意：使用热循环仪获得准确的温度和保持时间。 cDNA合成反应在0.2ml PCR 8管FLEX-FREE条中进行。
3. 第一链cDNA合成将在含有1x逆转录缓冲液（10mM Tris-HCl [pH 8.4]，25mM KCl），5mM MgCl 2，10mM二氨基苏糖醇的20μl反应体积中继续， 2U /μlRNase-OUT ^{TM（RNase抑制剂）和10U /μlSuperScript} III RT。将反应物加热至45℃90分钟，然后加热85℃5分钟。
4. 然后将反应冷却至37℃和0.1U /μl的E。大肠杆菌加入核糖核酸酶H，然后孵育20分钟。
5. 将每个样品的两个反应与温和的移液管混合结合，以避免剪切cDNA。将cDNA存储在-20℃直至需要。
gp120 和
的单基因组测序
1. 通常进行使用EB缓冲液的cDNA和基因组DNA（gDNA）稀释液以达到30％以下的阳性嵌套PCR反应，这表明阳性反应将具有一个起始模板的大于80％的几率。
  注意：
2. 在第一轮PCR期间，将1μl稀释的cDNA或基因组DNA在含有1×Platinum Blue PCR SuperMix的20μl反应物和0.05μM的每种引物：BEF1，5'-TAATAGCAATAGTTGTGTGG-3'和BNR1，5'-AGCTCCCAGGCTCAGATCT-3'（分别为6,111-6,130和9,558-9,576bp的HIV-1 HXB2）。
  1. 第一轮引物在反应体积中为0.05μM浓度，以消除未用过量的第一轮引物携带到第二轮PCR中。第二轮PCR中过量的第一轮引物产生非特异性PCR产物并减少所需产物的量。参见图1，了解通过第一轮PCR引物携带产生的非特异性PCR产物的实例
    
    图1.非特异性引物与基因组DNA结合的实施例。该凝胶提供了第一轮PCR引物的浓度在第一轮PCR中为0.2μM的实验实例。该浓度的第一轮引物在第二轮PCR中产生非特异性产物形成，如大多数孔中发现的较弱条带所见，无论这些孔是否具有对应于阳性对照的大小的亮带。当第一轮PCR引物以0.05μM使用时，这些次级产物不再可见，而正确大小的阳性PCR产物仍然可见，导致更容易解释结果并直接测序第二轮产品而无需进一步的凝胶纯化隔离单一乐队。
3. 第一轮PCR循环参数 - 初始变性94℃3分钟，然后40个循环94℃30秒，56℃30秒，72℃4分钟，最后延伸72℃ 10分钟。
  
  注意：
4. 第二轮gp120 PCR由2μl第一轮PCR产物加入到由1x Platinum Blue PCR SuperMix组成的20μl第二回合反应和0.2μM每种引物中：BEF2，5'-CAATAGTTGTGTGGTCCATAG-3'和BER2，5'-CAACAGATGCTGTTGCGC-3'（分别为6,117-6,137bp和7,905-7,922bp的HIV-1 HXB2）
5. 第二轮gp120 PCR循环参数 - 初始变性94℃3分钟，然后40个循环94℃30秒，56℃30秒，72℃3分钟，随后最终延长72°C 10分钟。
6. 第二轮gp120 PCR产物在1％琼脂糖凝胶上显色，所述琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中以150V运行30分钟。
  注意：
  
  这种第二轮PCR在阳性时产生1.8Kb的产物，其含有完整的gp120序列。来自阳性井的产物用BEF2和BER2引物进行测序。该方案产生可直接测序的单特异性PCR产物，不需要PCR纯化。参见图2，其中有两个不同的患者样本的成功的gp120第二轮PCR和来自另一个组织的DNA的稀释系列。
  
  我们使用白蛋白蓝色PCR SuperMix将负载第二轮产品引导到琼脂糖凝胶上，而不是在每个反应中混合加载染料。我们使用Matrix多通道电子移液器（范围：2-125μl; 12通道）在Sub-CellTM 192型电泳系统上自动加载。
  
  图2.第二轮gp120的实例PCR板琼脂糖凝胶图像。凝胶顶行使用的两个样品是两个患者的脾组织的未稀释的基因组DNA。两个样品具有等于小于30％的正极孔的总数，表明阳性孔最有可能来自存在于DNA中的单个整合的原始病毒基因组的巢式PCR扩增的gp120 那好底排（HC09SPd1 DIL_1）提供了连续稀释测试的例子，以评估正确的SGS稀释度。在这里测试四种稀释液，并且当所有四种稀释度都足够高以在正性阱中产生单个整合的原病毒的扩增时，所有四种稀释度都太高，以获得许多阳性反应，导致浪费的试剂。理想情况是找到稀释液，其中20-30％的孔是阳性的，因此必须测试较低的稀释度以找到最佳稀释度。凝胶上没有标记阴性对照，A1为良好，阳性对照（标记为POS）为H12。阴性对照具有1μl用于稀释DNA的水，阳性对照是来自不在以前实验中为阳性的cART的患者的稀释的基因组DNA。
7. 随后，使用对应于阳性第二轮gp120 PCR的第一轮反应来扩增基因序列; PCR第二轮PCR由2μl第一轮PCR加入到由1×Platinum Blue PCR SuperMix组成的20μl第二轮反应中，每种引物0.2μM： BNF1，5'-CTGGCTGTGGAAAGATACCT-3'和BNR2，5'-ATCTGAGGGCTCGCCACT-3'（分别为7,965-7,984bp和9,488-9,505 HIV-1 HXB2）。
8. 循环参数 - 初始变性94℃3分钟，接着是40个循环，94℃30秒，58℃30秒，72℃2分钟，然后是最终在72℃延伸10分钟
9. 第二轮在1×TAE缓冲液中，PCR产物在1％琼脂糖凝胶上显色，用溴化乙锭在150V下运行30分钟。
  注意：含有单个1.5 Kb产物的反应被认为是阳性的，并选择用于BNF1和BNR2的测序。该方案产生可直接测序的单特异性PCR产物，不需要PCR纯化。

数据分析

在佛罗里达大学生物技术研究中心（UF ICBR）的Applied Biosystems 3730xl DNA分析仪上进行测序，使用BEF2/BER2引物用于gp120和BNF1/BNR2引物用于nef 的测序。使用Geneious R7软件包（Biomatters http：/...）组装每个测序PCR产物的正向和反向色谱图， /www.geneious.com ），并在可能的情况下用手进行优化，以解决由序列器分配的模糊排序调用或装配算法的虚假间隔。没有使用具有默认设置的Geneious自动装配算法组装的正向和反向色谱图被丢弃，通常这些是质量非常差的序列（由定序器精确调色的太多重叠峰）或非常短的长度（小于600碱基对）。对于在两个或更多个碱基对中发现多个色谱峰的组合，在起始模板的初始扩增中指示多个起始模板或多个PCR错误，从进一步分析中除去这些序列。使用Geneious软件包从每个优化组合中提取共有序列。使用MEGA5（Tamura等人，2011）中的ClustalW（Thompson等人，1997），利用手工进一步优化来消除共识序列，以消除由对齐算法。分别位于相对于HXB2基因组的位置6,213-7,823和位置8,797-9,411的最终 env 和 nef 对齐。由于大量的天然存在的插入和缺失，通常有问题地排列并可能偏向系统发育分析，排除了env （V1，V2和V4域）中的高变区。使用PhyML估计每个基因的初步最大似然系统发育（ http：//www.atgc-montpellier.fr/phyml/）和来自所有参与者的序列，以确保不发生患者的交叉污染。使用HYPERMUTE工具测试序列是否存在超突变（ http：//www.lanl .GOV ）;具有< P<> - 值的序列<从对准中除去0.01。使用该协议生成的实例序列已提交给GenBank（登录号KU708874-KU709831）。

笔记

在考虑SGS实验的结果时，请记住几个想法：

基于病毒基因组的变化，引物结合效率可能因患者，亚型或病毒基因而异。筛选每组具有针对患者亚型特异性的多组引物的每个患者，并发现一致的结果将增加测序结果的置信度。发现在本文中提出的用于gp120-nef 的SGS方案的阴性组织也应该使用在HIV基因组的更保守区域中的引物进行评估，如gag （Norstr？ et al。，2012）或 pol （Palmer等人，1999; Shafer等人，2000）以确认没有病毒。使用诸如QUALITY（Rodrigo等人，1997）的程序根据SGS稀释（Rife等人，2016）估算不同引物组的SGS结果的拷贝数也可以提供每组的绑定效率的数据。此外，替代的gp120/nef引物（Lamers等人，2016b）可以用于确认由于引物的引物结合效率而导致的一些变体不被遗漏这里。从这些替代引物产生的序列可以包括在系统发育分析中，以评估原始引物捕获组织中病毒多样性景观的效率。实时或定量PCR也可用于评估SGS结果的正或负值（Lamers等人，2016a）。
组织型可影响DNA和RNA的分离。 Qiagen Allprep试剂盒有一些关于改变不同组织类型提高隔离效率的方法的详细说明。对于始终导致低产量的组织，应考虑替代试剂盒或方案。组织保存也会影响分离结果，并且应该谨慎处理组织以防止过早解冻。在多个组织切片上进行的分离分离将增加对SGS结果的信心。来自同一患者的组织应尽可能分开处理，因为来自同一患者的样品的交叉污染物将不会像所有生成的所有序列的初始系统发育分析期间容易地识别为患者之间的混合。

食谱

50x TAE库存解决方案
准备1L 50x TAE溶解以下组分：
在600毫升去离子水中：
242g Tris碱（FW = 121）
57.1毫升冰醋酸
100ml 0.5M EDTA（pH8.0）
1x TAE缓冲区
40mM Tris（pH 7.6）
20mM乙酸
1 mM EDTA
稀释1:50用于1×TAE缓冲液进行凝胶电泳

致谢

这项HIV-1测序方案的开发资金由美国国家卫生研究院（NIH）通过R01 MH100984资助提供，并基于以前的NIH授权R01 NS063897开发的方法。我们要感谢国家神经系统艾滋病银行（NNAB，UM1 CA181255）和艾滋病和癌症标本资源（ACSR，UM1 CA181255）提供用于开发协议的组织，并生成出版数据，特别是Elyse Singer（NNAB），Debra Garcia（ACSR）和Salman Mahboob（ACSR）。我们还要感谢并感谢MelissaNorström（以前的Karolinska Institutet），最初向我们介绍了用于"gag"基因的HIV-1单基因组测序技术。该方法根据先前出版物的协议（Palmer等人，2005;Norström等人，2012; Lamers等人，2015年） ; Rife等人，2016）。

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