材料和试剂

电子。大肠杆菌RNA聚合酶 70全酶
注意：如Mukhopadhyay等人所述。（2003）或购买（New England Biolabs，目录号：M0551S）
电子。大肠杆菌RNA聚合酶核心酶
注意：如Artimovitch等人所做的那样。（2003）。
电子。大肠杆菌σ⁷⁰
注：准备为Marr和Roberts（1997）; Perdue和Roberts（2010）。
（I级，游离酸）（Roche Molecular Systems，目录号：10127965001）
NADH（I级，游离酸）（Roche Molecular Systems，目录号：10107735001）
Phusion Flash HF主混合物（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：F548L）
注意：用于生成转录模板。
寡脱氧核糖核苷酸（模板和引物）（Integrated DNA Technologies， www.IDTdna.com ）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28106）
TEMED（Avantor Performance Materials，J.T.Baker ^{®，目录号：4098-01）}
过硫酸铵（VWR，AMRESCO，目录号：97064-594）
GeneMate LE快速溶解琼脂糖（BioExpress，目录号：E-3119-500）
3'-去磷酸酶A（Sigma-Aldrich，目录号：D3385）
SequaGel测序系统（国家诊断，目录号：EC-833）
高纯度rNTP组（ATP，UTP，GTP，CTP）（100mM）（GE Healthcare，目录号：27-2025-01）
[A-32] PTP-CTP EasyTide（3,000Ci/mmol）（250μCi）（Perkin Elmer，目录号：BLU508H250UC）
Tris碱（VWR，AMRESCO，目录号：97061-800）
氯化钾（KCl）（EMD Millipore，目录号：PX1405-1）
六水合氯化镁（EMD Millipore，目录号：5980-500GM）
EDTA二钠盐水合物（1kg）（VWR，AMRESCO，目录号：97061-018）
二硫苏糖醇（DTT）（Gold Bio，目录号：DTT50）
牛血清白蛋白（BSA）级分V（Alfa Aesar，Affymetrix/USB，目录号：J10857）
十二烷基硫酸钠（SDS）（VWR，AMRESCO，目录号：97064-470）
去离子甲酰胺（EMD Millipore，目录号：4610-100ML）
二甲苯胞苷（Sigma-Aldrich，目录号：X4126-10G）
溴苯酚蓝（EMD Millipore，目录号：BX1410-7）
苋菜红（Acros Organics，目录号：AC15303-0250）
硼酸（ACS级）（VWR，AMRESCO，目录号：97061-980）
乙酸钠，三水合物（Avantor Performance Materials，MACRON，目录号：7364-06）
盐酸（ACS plus）（Fisher Scientific，目录号：A144-212）
甘油（ACS级）（EMD Millipore，目录号：GX0185-5）
转录缓冲液（1x）（见配方）
转录缓冲液（5x）（见配方）
转录停止缓冲液（见配方）
三硼酸盐EDTA缓冲液（TBE）（参见食谱）
TBE + 0.3M醋酸钠（参见食谱）

设备

NanoDrop 2000c分光光度计ND2000C（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：NanoDrop ^TM 2000/2000c，目录号：ND-2000C）}
玻璃板
块数字加热器带有20个锥形孔块（VWR，目录号：12621-088; 13259-002）
5424台式离心机，带有FA-45-24-11转子（Eppendorf，mdoel：5424/5424 R，目录号：5424000410）
Powerpack HV电源（Bio-Rad实验室，型号：PowerPac HV电源，目录号：1645056）
SequiGGGG测序凝胶系统（38×30cm凝胶）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1653862）
注意：本产品已停产。
Hydrotech真空泵（Bio-Rad Laboratories，目录号：1651781）
583型凝胶干燥器（Bio-Rad Laboratories，型号：Model 583，目录号：1651745）
DNA引擎染色体PCR机4×48孔块（Bio-Rad Laboratories）
未安装的荧光体曝光屏（35×43厘米）（GE Healthcare，型号：通用屏幕，目录号：63-0034-79）
Storm 840扫描仪（分子动力学，型号：Storm 840）
Windows计算机（HP，型号：Compaq dc7700）

软件

Excel（Microsoft）
ImageQuant（GE）
SigmaPlot（Systat）

程序

注意：

所述方法用于分析大肠杆菌RNAP和转录起始因子σ^{70。该方法可以适用于任何其它RNAP的分析，用目标RNAP替换大肠杆菌RNAP，用感兴趣的RNAP所使用的转录起始因子代替转录因子σ^{70 ，用目标RNAP所使用的启动子取代启动子，用适合感兴趣的RNAP的转录缓冲液代替转录缓冲液。}}
DNA模板设计用于促进使用NAD ，NADH，dpCoA或ATP形成的定义的初始RNA产物的产生和分析作为引发底物（图2A）。使用NAD ⁺，NADH，dpCoA或ATP的起始在转录起始位点（位置+1; Bird等人，2016）需要A：T（即模板链T）。使用CTP作为延伸核苷酸需要在转录起始位点（位置+2）下游的第一个位置使用C：G（即模板链G）。产生代表一个且仅一个核苷酸加成反应的定义的初始RNA产物需要T：A或C：G（即与反应中存在的NTP不互补的模板链A或G）。 >

图2.用NAD确定转录起始的相对效率 + vs。包含RNAI和T7A1启动子（位置-40至+3;灰盒中的启动子元件和转录起始位点）的dsDNA转录模板; B.代表性原始数据（在1mM NAD +，0.01-0.5mM ATP和[α^{32 P] -CTP的存在下进行的转录反应的初始RNA产物作为扩增核苷酸C和D.与ATP转录起始的相对效率（ATP}）与ATP的转录起始[（k /K> ，NCIN）/（k /K> M，ATP）]使用对数回归计算（C;用NAD ^{（C）或非线性回归（D）中的0.2和0.8之间的平均值/（pppApC + NAD ⁺ pC）值;用NAD <} pC /（pppApC + NAD ⁺ pC）值介于0和1之间。

生成转录模板
1. 准备模板和底漆如下：
  1. 对应于启动子模板链位置-65至+35（"模板"; IDT，Inc。;溶于水至100μM）的100nt寡脱氧核糖核苷酸。
  2. 与启动子模板链位置-65至-46（"正向引物"; IDT，Inc。;溶于水至100μM）互补的20nt寡脱氧核糖核苷酸。
  3. 与启动子模板链位置相同的20nt寡脱氧核糖核苷酸+16至+35（"反向引物"; IDT，Inc。;溶于水至100μM）。
2. 运行PCR如下（35个循环）：
  
  PCR循环：
3. 使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物（每个PCR反应两个柱，每个在40-50μl水中洗脱）。（需要两列，因为DNA量超过单柱的结合能力。）
4. 通过2％琼脂糖凝胶电泳分析等分试样，以确认100 bp双链DNA片段（'dsDNA转录模板'）的产生。
5. 通过紫外 - 可见分光光度法测定dsDNA转录模板，并在水中调节浓度至0.5-1μM
转录反应
模板+ RNAP组合

NCIN + NTP混合

注意：将水，5x转录缓冲液[α]/P> -CTP，CTP和NCIN预先混合至产生"主混合物"，其中4μl加入到1μl适当的ATP稀释液中
1. 在37℃下孵育模板+ RNAP混合物15分钟，以形成催化能力的RNAP启动子开放复合物。
2. 将5μlTemplate + RNAP混合物加入预热的NCIN + NTP混合物中，37℃孵育10分钟。
3. 加入10μl冰冷的停止缓冲液。（如果要立即加载凝胶，请将样品保存在冰上，如果要稍后加载凝胶，则保存在-20°C。）
  注意：在加载凝胶之前，不要煮含含有NCIN封端RNA的样品。（NCIN可以是热不稳定的。）
4. 通过7.5M尿素20％聚丙烯酰胺核苷酸测序凝胶电泳分析产物（National Diagnostics，Inc。;根据供应商的说明制备，但使用一半的特定过硫酸铵和Temed浓度）
  1. 倒凝胶。
  2. 预装凝胶在50 W下加载样品（顶部储存缓冲液，TBE;底部储存缓冲液，含0.3M乙酸钠的TBE）20-60分钟。
  3. 加载样品（每泳道5μl）可选：在与样品通道相邻的通道中，加入1μl转录停止缓冲液，加入0.025％苋菜红作为标记。苋菜红类似地迁移到免费的NTPs，并允许视觉估计二核苷酸产物的迁移
  4. 以50W（如上所述的缓冲液）运行凝胶120分钟或达到理想的分离注意：向底部储存器缓冲液中加入0.3M乙酸钠产生盐梯度，其压缩并提高短RNA产物的分辨率（Vo等人，2003）。
5. 拆解凝胶装置。在玻璃板上用聚乙烯包裹包裹凝胶，并在4℃下暴露于储存荧光屏3-18小时

数据分析

使用存储荧光成像仪（Storm，Typhoon或等同物; GE，Inc.）扫描存储荧光屏。
在ImageQuant（GE，Inc.）中打开凝胶图像。并使用以下方法之一量化带强度：

框方法：使用ImageQuant'Rectangle'工具，在感兴趣的频段（在第一个频段的定义框，然后复制和粘贴框到每个其他感兴趣的频段）中绘制统一大小的框。执行背景校正（通过使用ImageQuant'背景校正'工具来定义和减去平均背景，或通过手动减去放置在没有波段的区域中的相同大小的框的背景）。使用ImageQuant'Volume Report'工具量化频带强度。
线方法：使用ImageQuant'Line'工具，通过每个通道垂直绘制均匀宽度的线（定义线和调整线宽比第一个通道的带略窄，然后将线复制并粘贴到每个通道）。使用ImageQuant"创建图形"工具，在每个通道的行下创建图形报告区域，使用ImageQuant'Peak Finder'工具或ImageQuant'Define Peak'，'Split Peak'和base-line-调整工具使用ImageQuant'区域报告'工具量化频带强度。

计算NCIN介导的起始与ATP介导的起始的相对效率（NCIN）/（k cat） ATP/K ATP）]，使用以下方法之一：

对数回归（使用Excel或SigmaPlot）：在半对数图上绘制NCINpC /（pppApC + NCINpC）对[NCIN]/[ATP]的观察值，仅使用观察到的NCINpC /（pppApC + NCINpC）值在0.2和0.8 [ ie ，仅使用可以近似为行的部分的NCINpC /（pppApC + NCINpC）的值]。执行对数回归，拟合数据到：

y = y + a [ln（ x ）]

其中， y 是NCINpC /（pppApC + NCINpC）， x 是[NCIN]/[ATP]，而 y _{> 0}和 a 是回归参数。所得到的拟合产生 x = 0.5的值。 ATP的相对效率（kN）/N m N，NCIN）/（k cat/N/K M）等于1/x 。
非线性回归（使用SigmaPlot）：使用NCINpC /（pppApC + NCINpC）的所有观察值，在半对数图上绘制NCINpC /（pppApC + NCINpC）与[NCIN]/[ATP]的观察值的比较[ > ie ，使用NCINpC /（pppApC + NCINpC）的值，不仅可以将曲线中可以近似为线的部分，也可以用于不能近似为线的曲线部分]。执行非线性回归，拟合数据到：

其中， y 是NCINpC /（pppApC + NCINpC）， x 是[NCIN]/[ATP]，而 a 和是回归参数。所得到的拟合产生 x = 0.5的值。 ATP的相对效率（kN）/N m N，NCIN）/（k cat/N/K M）等于1/x 。

食谱

转录缓冲液（1x）
10 mM Tris HCl pH 8.0
40 mM KCl
10mM MgCl 2
0.1 mM EDTA
1 mM DTT
0.1 mg/ml BSA
转录缓冲液（5x）
50 mM Tris HCl pH 8.0
200 mM KCl
50mM MgCl 2
0.5 mM EDTA
5 mM DTT
0.5 mg/ml BSA
转录停止缓冲区
100mM Tris HCl pH 8.0
18 mM EDTA
1.25％SDS
90％甲酰胺
0.025％二甲苯氰胺
0.025％溴酚蓝
0.025％苋菜红
三硼酸盐EDTA缓冲液（TBE）
90 mM Tris碱基
90 mM硼酸
2mM EDTA二钠盐
TBE + 0.3M醋酸钠
90 mM Tris碱基
90 mM硼酸
2mM EDTA二钠盐
300 mM醋酸钠

致谢

这项工作得到了美国国家卫生研究院授予GM118059（B.E.N.）和GM041376（R.H.E.）的支持。该方案适用于Bird等人报道的方法（2016）。

参考

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