材料和试剂

Eppendorf管（1.5-2.0毫升）
比色皿1.5毫升（BRAND，目录号：759115）
CO ₂ tank
小球藻sorokininana Shihira&克劳斯，应变211/8K（剑桥大学CCAP）（图2）
液氮
Milli-Q水
O-乙酰丝氨酸（OAS）（Sigma-Aldrich，目录号：CDS020792）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）
硫化钠九水合物（Na 2 S·9H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S2006）
三氯乙酸（TCA）（Sigma-Aldrich，目录号：91228）
乙酸（CH 3 COOH）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker ，目录号：401424）
乙醇（EtOH）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker ^{，目录号：8007）}
Bio-Rad蛋白测定染料浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
磷酸氢二钾（K 2/2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：04248）
注意：本产品已停产。
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M2643）
乙二胺四乙酸铁盐钠盐（Fe-EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6760）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
硝酸钾（KNO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：P8291）
硫酸铜（II）（CuSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：451657）
钼酸铵四水合物，（NH 4）6族Mo 7 O 24·4H 2/sub > O（Sigma-Aldrich，目录号：M1019）
氯化锰（II）（MnCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：13217）
注意：本产品已停产。
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：Z0251）
硼酸（H 3 O 3 BO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
吡哆醛 - 磷酸（PLP）（Sigma-Aldrich，目录号：P3657）
茚三酮（Sigma-Aldrich，目录号：N4876）
盐酸37％（Avantor Performance Materials，J.T.Baker ^{®，目录号：6012）}
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7030）
基础培养基（见食谱）
磷酸盐缓冲液（见配方）
提取缓冲液（见配方）
茚三酮溶液（参见食谱）
1 M HEPES溶液（参见食谱）

设备

培养瓶（WHEATON，目录号：356954）
荧光灯（飞利浦照明，型号：TL-D 30W/55）
台式离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：IEC CL30）}
法国压力机（AMINCO RESOURCES，型号：FA-078）
超速离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Sorvall RC-5C Plus）}
涡街搅拌机（Troemner，目录号：945302）
Eppendorf ThermoMixer ^® Comfort（Eppendorf，型号：5355）
Eppendorf MiniSpin ^®（Eppendorf，型号：5453000011）
热浴（Labortechnik medingen，型号：MWB 5）
分光光度计（Cole-Parmer，JENWAY，型号：7315）
光学显微镜（Esselte，Leitz，型号：Leitz Laborlux K）

软件

SigmaPlot ^® 12软件

程序

藻类培养条件
在基础培养基（见食谱）中，在35℃和连续照射下（荧光灯，250μmol光子）在秒下生长小球藻sorokiniana 1 ）。用含有5％CO 2的空气鼓泡培养物。在这些条件下，藻类生长速率常数（μ）为3 d ^-1
微藻提取物的制备
1. 通过离心（4,500×g×10分钟）收获200ml藻类培养物。在指数生长阶段（培养物OD 550在0.5和1.0之间）收集细胞。
2. 丢弃上清液，并将沉淀重新悬浮在5ml冷（4℃）提取缓冲液中（见食谱）。
3. 通过两次通过法国压力池（1,100psi）使细胞裂解。
  注意：其他方法和程序可用于裂解微藻;在最常见的方法中，使用磁力搅拌器，微波辐射，超声波和酶处理（Dvoretskyet al。，2016; Farooq等，2016; Huang等，2016）。可以用光学显微镜观察细胞的破裂。
4. 离心细胞匀浆在11,000xg下于4℃15分钟。使用所得上清液作为粗提物（CE），并测定其酶活性
5. 将粗提物保存在冰上，或将样品冷冻在液氮中，储存于-80°C，以备将来测定注意：将样品储存在-80°C最多6个月。冻结的样品可在室温下解冻。
OASTL分析
1. 将如表1所示的以下解决方案添加到Eppendorf管（1.5-2.0 ml）
  中
  表1. OASTL协议测定
  
  注意：
  1. 对于制备反应混合物，重要的是遵守表1所示的解决方案顺序。
  2. 考虑到100μl的反应混合物的最终体积，样品中的Milli-Q水的体积取决于所用的CE的量。
  3. 在使用前，需要准备新鲜的OAS（O-乙酰丝氨酸）。 DTT和Na 2 S可以制备，等分并在-20℃下储存六个月。
2. 在制备反应混合物后，旋转样品并在50℃的温热混合器中孵育管5分钟。
3. 加入50μl20％（v/v）三氯乙酸（TCA）停止反应。旋转13,000 x g，并将上清液转移至干净的管中注意：TCA可以在4°C储存六个月。
4. 加入管100μl冰醋酸和200μl茚三酮溶液（参见食谱）。
5. 将样品在100℃孵育5分钟，然后在10℃的Thermo浴中冷却5分钟。
  注意：作为Thermo bath的替代品，样品可以在99℃的温热混合器中孵育。
6. 加入550μl乙醇，旋转，并在560 nm下用光度法测定吸光度。

程序

藻类培养条件
在基础培养基（见食谱）中，在35℃和连续照射下（荧光灯，250μmol光子）在秒下生长小球藻sorokiniana 1 ）。用于含有5％CO 2的空气鼓泡培养物。在这些条件下，藻类生长速率常数（μ）为3 d ^-1
微藻提取物的制备
1. 通过离心（4,500×g×10分钟）收获200ml藻类培养物。在指数生长阶段（培养物OD 550在0.5和1.0之间）收集细胞。
2. 丢弃上清液，并将沉淀重新悬浮在5ml冷（4℃）提取缓冲液中（见食谱）。
3. 通过两次通过法国压力池（1,100psi）使细胞裂解。
  注意：其他方法和程序可用于裂解微藻;在最常见的方法中，使用磁力搅拌器，微波辐射，超声波和酶处理（Dvoretskyet al。，2016;法鲁克等2016;黄等，2016）。可以用光学显微镜观察细胞的破裂。
4. 离心细胞匀浆在11,000xg下于4℃15分钟。使用所得上清液作为粗提物（CE），并测定其酶活性
5. 将粗提物保存在冰上，或将样品冷冻在液氮中，储存于-80℃，以备将来测定注意：将样品储存在-80°C最多6个月。冻结的样品可在室温下解冻。
OASTL分析
1. 将如表1所示的以下解决方案添加到Eppendorf管（1.5-2.0 ml）
  中
  的表1。 OASTL协议测定
  
  注意：
  1. 对于制备反应混合物，重要的是遵守表1所示的解决方案顺序。
  2. 考虑到100μl的反应混合物的最终体积，样品中的Milli-Q水的体积取决于所用的CE的量。
  3. 在使用前，需要准备新鲜的OAS（O-乙酰丝氨酸）。DTT和Na 2 S可以制备，等分并在-20℃下储存六个月。
2. 在制备反应混合物后，旋转样品并在50℃的温热混合器中孵育管5分钟。
3. 加入50μl20％（v/v）三氯乙酸（TCA）停止反应旋转13,000 x g，并将上清液转移至干净的管中注意：TCA可以在4°C储存六个月。
4. 加入管100μl冰醋酸和200μl茚三酮溶液（参见食谱）
5. 将样品在100℃孵育5分钟，然后在10℃的热浴中冷却5分钟。
  注意：作为Thermo bath的替代品，样品可以在99℃的温热混合器中孵育。
6. 加入550μl乙醇，旋转，并在560 nm下用光度法测定吸光度

食谱

基础培养基
13mM KH PO 4
4.3mM K 2 HPO 4
0.35 mM NaCl
1.2mM MgSO 4
0.35 mM Fe-EDTA
0.18mM CaCl 2
5mM KNO 3
Oligoelements：0.31mM CuSO 4，0.12mM（NH 4）6 6 Mo 7 O 24，/sub> 14mM MnCl 2，0.76mM ZnSO 4，46mM H 3 BO 3/Br /> 调节pH至6.5并通过高压灭菌消毒。介质储存在2-8°C，黑暗中
磷酸盐缓冲液，pH 7.5 为了制备pH 7.5的50mM磷酸盐缓冲液，将0.94ml 1M KH 2 PO 4与4.06ml 1KH 2 HPO _{> 4}，加入蒸馏水至最终体积为100 ml 注意：将缓冲液存放在2-8°C三个月。使用前应测量pH值，必要时进行调整。
提取缓冲区
50mM磷酸盐缓冲液pH7.5
10μMPLP（吡哆醛 - 磷酸盐）
1mM DTT（二硫苏糖醇）
注意：使用前请准备好。
茚三酮溶液
为了制备茚三酮溶液，将0.12g茚三酮溶于3ml冰醋酸和2ml盐酸中37％
注意：茚三酮溶液可以在室温黑暗中储存五天。
1 M HEPES解决方案
将11.9g HEPES溶于Milli-Q水中，最终体积为50ml ml 用KOH调节pH至7.20 注意：将缓冲液存放在2-8°C三个月。使用前应测量pH值，必要时进行调整。

致谢

我们感谢匿名评论者有用的评论。这项研究由Regione Campania（PON-Smart Generation和LR 5/2002）资助。

参考

Birke，H.，Heeg，C.，Wirtz，M.and Hell，R。（2013）。成功的受精需要在拟南芥花粉中存在至少一种主要O-乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶用于半胱氨酸合成。植物生理学163（2）：959-972。
Bradford，MA（1976）。快速敏感的方法用于利用蛋白质 - 染料结合原理定量微量的蛋白质。
Anal Biochem 72：248-254。
Bromke，MA（2013）。氨基酸生物合成途径硅藻。代谢物3（2）：294-311。
Burnell，JN和Whatley，FR（1977）。硫磺副反应芽孢杆菌中的代谢。丝氨酸转乙酰酶，O-乙酰丝氨酸巯基酶和β-胱硫醚酶的纯化，性质和调节。生物化学Biophys Acta 481（1）：246-265。
Carfagna，S.，Bottone，C.，Cataletto，PR，Petriccione，M.，Pinto，G.，Salbitani，G.，Vona，V.，Pollio，A.and Ciniglia，C。（2016）一个class ="ke-insertfile"href ="https://www.pubfacts.com/fulltext/27388343/Impact-of-Sulfur-Starvation-in-Autotrophic-and-Heterotrophic-Cultures-of-the-Eremremophilic-Microalga -Galdieria-phlegrea-Cyanidiophyceae"target ="_ blank">极地微量藻类（Cyanidiophyceae）的自养和异养培养物中的硫饥饿的影响植物细胞生理学
Carfagna，S.，Salbitani，G.，Bottone，C.，De Marco，A.and Vona，V.（2015）。 C ross-effects of小球藻2112/8K中的氮和硫饥饿。 Nat Resour 6：221-229。
Carfagna，S.，Salbitani，G.，Vona，V. and Esposito，S。（2011）。响应于S营养状态，微藻中的半胱氨酸和O-乙酰-L-丝氨酸水平的变化。 > J Plant Physiol 168（18）：2188-2195。
Dvoretsky，D.，Dvoretsky，S.，Temnov，M.，Akulinin，E.和Peshkova，E。（2016）。来自微藻的增强脂质提取小球藻生物质：实验，建模，优化。 49：175-180。
Farooq，W.，Mishra，SK，Moon，M.，Suh，WI，Shrivastav，A.，Kumar，K.，Kwon，JH，Park，MS和Mu，Y。（2016）。使用三碘化物树脂进行石油采收的微藻细胞破坏的节能工艺。 Algal Res 13：102-108。
Gaitonde，MK（1967）。光谱测定在其他天然存在的氨基酸存在下直接测定半胱氨酸的方法。生物化学杂志104：627-633。
地狱。 R.和Wirtz，M.（2008）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-1-4020-6863-8_4#page -1"target ="_ blank">植物和光营养细菌中半胱氨酸的代谢。在：Hell，R.，Dahl，C.and Leustek，T。（Eds。）。光合有机体中的硫代谢。 pp：61-94。
Huang，Y.，Qin，S.，Zhang，D.，Li，L.and Mu，Y.（2016）。通过压力辅助臭氧化和超声波处理对小球藻细胞破坏的评估能量 13：173-184。
Jost，R.，Berkowitz，O.，Wirtz，M.，Hopkins，L.，Hawkesford，MJ和Hell，R。（2000）。编码O-乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶的oa 基因家族的基因组和功能表征，催化最终步骤的酶在拟南芥中的半胱氨酸生物合成中。基因253（2）：237-247。
Lèon，J.，Romero，LC，Galvan，F.and Vega，JM（1987）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt= 7736730http：//www.sciencedirect.com/science/article/pii/016894528790118X"target ="_ blank">来自莱茵衣藻的O-乙酰基-1-丝氨酸巯基化酶的纯化和物理化学表征a>植物科学53（2）：93-99。
商人，SS，Prochnik，SE，Vallon，O.，Harris，EH，Karpowicz，SJ，Witman，GB，Terry，A.，Salamov，A.，Fritz-Laylin，LK，Marechal-Drouard，L.，Marshall， WF，Qu，LH，Nelson，DR，Sanderfoot，AA，Spalding，MH，Kapitonov，VV，Ren，Q.，Ferris，P.，Lindquist，E.，Shapiro，H.，Lucas，SM，Grimwood，，Schmutz，J.，Cardol，P.，Cerutti，H.，Chanfreau，G.，Chen，CL，Cognat，V.，Croft，MT，Dent，R.，Dutcher，S.，Fernandez，E.，Fukuzawa ，H.，Gonzalez-Ballester，D.，Gonzalez-Halphen，D.，Hallmann，A.，Hanikenne，M.，Hippler，M.，Inwood，W.，Jabbari，K.，Kalanon，M.，Kuras， R.，Lefebvre，PA，Lemaire，SD，Lobanov，AV，Lohr，M.，Manuell，A.，Meier，I.，Mets，L.，Mittag，M.，Mittelmeier，T.，Moroney，JV，Moseley ，J.，Napoli，C.，Nedelcu，AM，Niyogi，K.，Novoselov，SV，Paulsen，IT，Pazour，G.，Purton，S.，Ral，JP，Riano-Pachon，DM，Riekhof，W. ，Rymarquis，L.，Schroda，M.，Stern，D.，Umen，J.，Willows，R.，Wilson，N.，Zimmer，SL， Allmer，J.，Balk，J.，Bisova，K.，Chen，CJ，Elias，M.，Gendler，K.，Hauser，C.，Lamb，MR，Ledford，H.，Long，JC，Minagawa，J 。，Page，MD，Pan，J.，Pootakham，W.，Roje，S.，Rose，A.，Stahlberg，E.，Terauchi，AM，Yang，P.，Ball，S.，Bowler， Dieckmann，CL，Gladyshev，VN，Green，P.，Jorgensen，R.，Mayfield，S.，Mueller-Roeber，B.，Rajamani，S.，Sayre，RT，Brokstein，P.，Dubchak，I.，Goodstein ，D.，Hornick，L.，Huang，YW，Jhaveri，J.，Luo，Y.，Martinez，D.，Ngau，WC，Otillar，B.，Poliakov，A.，Porter，A.，Szajkowski，L 。，Werner，G.，Zhou，K.，Grigoriev，IV，Rokhsar，DS and Grossman，AR（2007）。基因组揭示了关键动物和植物功能的演变。科学318（5848 ）：245-250。
Prota，G.and Ponstglione，E.（1973）。在反应中的茚三酮与半胱氨酸及其类似物：修订版。四面体29（24）：4271-4274。
Rolland，N.，Droux，M.and Douce，R。（1992）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16668766"目标="_ blank">花椰菜中O-乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶的亚细胞分布。花序。植物生理学98（3）：927-935。
Salbitani，G.，Wirtz，M.，Hell，R.and Carfagna，S。（2014）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25093930"target ="_ blank">来自拟南芥的重组蛋白质从小球藻sorociniana中的O-乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶的亲和纯化代谢物4（3）：629-639。