材料和试剂

分离颈动脉
1. 固定胶带Durapore 1.25厘米（3M，目录号：1538-0）
2. 35 x 10 mm（2 x）（Corning，Falcon ^®，目录号：353001）的聚苯乙烯盘
3. Hanks平衡盐水溶液（HBSS）与CaCl 2和MgCl 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：1402550），pH 7.4
细胞悬浮液
1. 50ml管（3×）（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
2. 针27 G x 1.5（灰色）（BD，目录号：301629）
3. 注射器10 ml（1 x）（BD，Discardit ^TM目录号：309110）
4. 细胞过滤器50μm（Sysmex，CellTrics ^{®，目录号：25004-0042-2317）}
5. Hanks平衡盐水溶液（HBSS）与CaCl 2和MgCl 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：1402550），pH 7.4
6. 荧光细胞标记物：细胞追踪器绿（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen公司，目录号：C7025）和Red（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen公司，目录号：C34565） br />
7. 氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：A9434）
8. 碳酸氢钾（KHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：60339）
9. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
10. 裂解缓冲液（见配方）
动脉的安装
1. 玻璃蚀刻材料（NH 4 HF 2或NH 4 F·HF）（Carglass，目录号：ZB10 EI0003）
2. 针14 G x 80 mm，缩短并钝化至40 mm和50 mm（Braun Sterican 14 G x 80 mm）（B.Braun Medical，目录号：4665473）
3. 尼龙线Ø〜20μm，用于绑扎血管（Living Systems Instruments，目录号：THR-G）
4. 三路标签（2 x）（B.Braun Medical，目录号：4095111）
5. 注射器1ml（BD，Plastipak ^{TM，目录号：300026）}
6. 硅胶管3 x 1毫米（Carl Roth，目录号：9556.1）切成0.5米长度
7. Hanks平衡盐水溶液（HBSS）与CaCl 2和MgCl 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：1402550），pH 7.4
分子外渗
1. 硅胶管3 x 1 mm切割至1.0米长（Carl Roth，目录号：9556.1）
2. 针20 G x 1.5（黄色）（BD，目录号：301300）
3. 安全锁管1.5 ml（3 x）（Eppendorf，目录号：0030120086）
4. 注射器1ml（2×）（BD，Plastipak ^{TM，目录号：300026）}
5. 三向标签（B.Braun Medical，目录号：4095111）
6. 固定胶带Durapore 1.25厘米（3M，目录号：1538-0）
7. 人类Dil-LDL（Kalen Biomedical，目录号：770230-9）
8. Hanks平衡盐水溶液（HBSS）与CaCl 2和MgCl 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：1402550），pH 7.4
9. 直接缀合的抗CD31/eFluor450（PECAM：Thermo Fisher Scientific，eBioscience ^{TM，目录号：48-0311-82）
  替代方案：直接缀合的抗CD54/A488（ICAM：BioLegend，目录号：116112）或抗CD106/A594（VCAM：BioLegend，目录号：105724）}
流量分析
1. 硅胶管3 x 1 mm切割至1.5 m和1.0 m长度（Carl Roth，目录号：9556.1）
2. 针20 G x 1.5（黄色）（BD，目录号：301300）
3. 注射器1 ml（1 x）（见试剂C5）和10ml（2 x）（BD，Discardit ^{TM，目录号：309110）}
4. 三路标签（2 x）（B.Braun Medical，目录号：4095111）
5. 50ml管（2×）（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
6. 固定胶带Durapore 1.25厘米（3M，目录号：1538-0）
7. Hanks平衡盐水溶液（HBSS）与CaCl 2和MgCl 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：1402550），pH 7.4

设备

分离颈动脉
1. 笔
2. FST学生弹簧剪（精细科学工具，目录号：91500-09）
3. 杜邦镊子（2 x）（精细科学工具，目录号：91150-20）
4. 剪刀（精细科学工具，目录号：14084-08）
5. 立体显微镜Leica S8 Apo（LED光源和0.63x物镜）（Leica Microsystems，型号：Leica S8 Apo）
细胞悬浮液
1. 计时器
2. 笔（见设备A1）
3. 剪刀（精细科学工具，目录号：91401-12）
4. 1 ml移液器（Eppendorf，目录号：3120000062）
5. 离心机（Eppendorf，型号：5430）
6. 细胞计数室（Neubauer）
7. 细胞培养显微镜（Leica DMi1，相位对比度和10倍NA0.3目标）（Leica Microsystems，型号：Leica DMi1）
8. 流式细胞仪（BD，型号：BD FACSCANTO SYSTEM）
动脉的安装
1. 动脉造影室（2 x，荷兰马斯特里赫特大学IDEE ^©）
2. 玻璃移液管1.5 x 0.86 mm（2 x，哈佛仪器，目录号：30-0057）
3. 移液器拉杆（NARISHIGE，目录号：PP-830）
4. 移液器研磨机（荷兰马斯特里赫特大学IDEE ^©）
  替代方案：现成的玻璃移液器（Living Systems Instruments，目录号：GCP-300-325）
5. 硅胶套件，73清除（Farnell，目录号：101705）
6. 血压计（Riester，Big Ben ^{®，目录号：1453-100）适应于500ml空气室（Schott）和Luer连接器，以安装1 x 3 mm硅胶管（IDEE ^{© ;}，马斯特里赫特大学，荷兰）}
7. Luer耦合适配器母头（1x）（Carl Roth，目录号：CT62.1）
8. 立体显微镜Leica S8 Apo（带有LED光源和0.63x物镜）（Leica Microsystems，型号：Leica S8 Apo）
显微镜
1. 基于DM6000FS显微镜支架的市售徕卡SP5IIMP激光扫描显微镜系统（有关更多信息，请参阅制造商网站：
  https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-ii/downloads/）
  替代方案：使用≥2个检测器中的光谱特异性的任何功能性TPLSM和具有足够工作距离（≥1mm）的水浸物体可以与本文所述的测定结合使用。
2. 光谱物理MaiTai DeepSee Ti：Sa激光源
3. 徕卡混合探测器（4 x）
4. Luigs和Neumann SM7电动显微镜舞台
5. 徕卡20x NA1.00WD目标
6. 鲁丁气候控制/激光安全箱
分子外渗
1. 定时器（见设备B1）
2. 笔（见设备A1）
3. Luer耦合适配器：男性（1 x）（Carl Roth，目录号：CT58.1）和女性（1 x）（Carl Roth，目录号：CT62.1）
4. 注射器输液泵（Harvard Apparatus pump11 elite）（Harvard Apparatus，catalog number：70-4504）
流量分析
1. Luer耦合适配器：男性（2 x）（Carl Roth，目录号：CT58.1）和女性（1 x）（Carl Roth，目录号：CT62.1）
2. 注射器输液泵（Harvard Apparatus pump11 elite）（Harvard Apparatus，catalog number：70-4504）
3. 立柱与夹具（未知品牌，长度100厘米，占地面积15 x 25厘米）
4. 具有excel和/或用于细胞计数的纸的Pc

软件

Leica LAS AF 2.6采集软件
徕卡LAS X 3.11图像处理软件（含3D分析包）;离线
注意：可以使用允许用户处理多维数据的任何处理软件包。

程序

颈动脉分离
使用立体显微镜（见设备A5），按照当地的伦理委员会指南，分离小鼠颈动脉（分离后的长度，优选3-6mm），并将它们放置在聚苯乙烯盘（Ø35mm）中的HBBS（pH 7.4）中（见图1详细信息）。

图1.颈动脉的分离将安乐死的小鼠固定在立体显微镜（A）上，并使用剪刀（14084-08）去除颈部皮肤，并使用湿纸巾（B ）。下颌腺（I）变得可见。 C.将甲状腺（I）的一侧拉到外面，用Dumont镊子去除肌肉胸锁乳突肌（II）和肌肉XXXX（III）。 D.在一些细透明层下面，颈总动脉变得可见（IV）。仔细清除动脉上的组织，检查是否存在非典型侧分支。 E.此外，仔细地从分叉（绿色箭头）移除组织，并用蓝色线解剖清洁的颈总动脉（使用弹簧剪刀）。通过外端（杜蒙镊子）之一握住解剖的动脉，并将其放入填充有HBSS的小盘中以保持其潮湿。隔离后，动脉必须保持凉爽（冰箱或冰）直至进一步处理
有一些必须满足的先决条件，对于维持动脉生存能力和TPLSM成像至关重要：
1. 必须不惜一切代价避免容器受到挤压或过度拉伸造成的机械损伤，因为这将立即导致结构和功能的变化。
2. 空气与动脉的接触应尽量减少。隔开动脉同时保持伤口潮湿，解剖后迅速将动脉转移到培养基中。
3. 动脉必须非常干净才能进行成像。在动脉外侧的任何"污垢"，头发或组织将导致其下面的动脉部分的可视性丧失。所以工作细致，也清除覆盖动脉的薄片结缔组织注意：不推荐像通常用于收获主动脉的小鼠的循环冲洗，因为它可能会在影响内皮细胞的动脉内腔中引入气泡。冲洗可以通过临时安装（使用镊子，因此没有螺丝将其固定在适当位置）直接在隔离后进行，将灌注腔中的无空气单个玻璃移液管上的公共部分轻轻地冲洗通过其进行HBSS。然而，这必须在颈动脉分离后迅速（30分钟内）完成，以避免血块堵塞！（另见"动脉安装"一节中的程序。）
分离骨髓来源的白细胞
1. 按照当地的伦理委员会指南，分离小鼠的股骨和/或胫骨，将其置于HBBS（pH 7.4）中。
  注意：最方便的隔离方法是首先从后肢去除皮肤，然后拉扯后肢脱位髋关节。之后，通过在臀部区域切割，很容易去除后肢，没有切割骨的危险。去除后，剩下的肌肉和组织可以安全地取出。
2. 用剪刀切断骨骼的骨骼（头），使骨髓腔开放。
3. 用27 G针和10ml注射器将HBSS的骨头冲洗成50ml管注意：所有骨髓细胞从骨骼中移除是很重要的。使用所需的体积，直到几乎所有的细胞（红色）被清除。
4. 通过使用1 ml移液管重悬细胞来制备单细胞溶液。
5. 用50μm细胞过滤器过滤重悬的骨髓细胞，以减少最终细胞悬浮液中的组织
6. 以300×g离心细胞5分钟。
7. 用5ml裂解缓冲液（为了裂解红细胞）重悬细胞沉淀，并在室温下孵育1分钟。
8. 以300×g离心细胞5分钟。
  注意：如果需要，可以根据实验室特异性方案分离不同的白细胞亚群（例如单核细胞，嗜中性粒细胞和淋巴细胞）。
9. 通过在HBSS中稀释细胞跟踪器1：1,000来准备细胞追踪器解决方案。
  注意：细胞跟踪器的不同颜色可用于区分白细胞亚群（例如，单核细胞，嗜中性粒细胞和淋巴细胞）或不同白细胞来源之间（例如野生型与淘汰型） />
10. 将细胞重悬于准备的细胞追踪器溶液中（总体积为3ml /白细胞亚群/来源）
11. 在室温下孵育15分钟。
  注意：
12. 在染色程序后洗涤细胞悬浮液两次，重悬于3ml HBSS中，使用50ml管，以300×g离心5分钟。
  注意：洗涤细胞是至关重要的，以避免造成造成对比度损失的准备的细胞悬浮液中未结合的细胞追踪器导致血管壁的整体染色！
13. 使用Neubauer室和显微镜（相位对比）计数每个白细胞亚群/来源的细胞总数。
14. 混合两种类型的白细胞（2种不同的亚类或来源，用不同的颜色标记以区分它们）以达到在总共6ml HBSS中重新悬浮的1:1比例。
15. 每个白细胞组的细胞密度应为1.5×10 6个白细胞（因此，每个流式测定的悬浮液中的细胞总数在6ml HBSS中为3×10 6）。
16. 通过流式细胞术分析所得到的白细胞悬浮液，以确认1：1的比例。
动脉造影室的准备
1. 通过使用移液器拉拔器（加热器= 60;重量= 3×大块）和研磨机设置，从0.58 x 1 x 80 mm玻璃管中拉出并研磨移液器。目标是产生长度为40mm和50mm的移液管，并且尖端直径为250-350μm，具有45°的尖角。可以使用任何明视野显微镜（≈100x放大倍率）和比例尺幻灯片检查尖端尺寸和角度（见图2）。
  
  图2.微量移液器构造 A.概述用于自制灌注腔的图像微量移液器。将玻璃微量移液管胶合成钝化并缩短的14 G针（绿色，总长约50 mm）。 B.玻璃移液管从钝头针上伸出大约0.8-10毫米。 C.关闭尖端直径为250-300微米的移液管尖端，并研磨以获得45度角。在胶合和研磨之后，蚀刻尖端以产生粗糙的玻璃表面（不可见），为安装动脉提供更好的摩擦。
2. 将研磨的移液管的尖端通过NH 4或HF 4 HF/HF或HF 4 H 3 F·HF化合物吸到研磨的移液管的尖端（一个罐简单地将开头的容器中的化合物中的尖端保持几毫米）。（10-20分钟或蚀刻工艺成功时），手术后用蒸馏水小心冲洗干燥（RT）。蚀刻的技巧可以使动脉更稳定地绑在玻璃上。
  注意：由于动脉造影室设计的差异，各种腔室的移液器的制备和性质不同。这种方法的移液器最重要的特性是尖端开口直径和尖端的45°角形状，因为两者直接影响动脉内的流动模式。
3. 通过使用小文件使圆形边缘切割14 G针，然后使用小的钳子打破尖端，并使用砂纸去除任何锋利的边缘。针应该有40毫米和50毫米的长度（50毫米为腔室的调节器一侧）
4. 使用硅胶套将玻璃移液器胶入缩短且钝的20 G针中。确保玻璃和钢针之间的空间完全关闭，以确保结构的气密性。此外，确保玻璃移液管的非磨削外边缘刚到达20 G针的Luer-lock连接器，以避免碎屑堆积在构件内的未填充空间中。
5. 在手术后用蒸馏水小心冲洗造成的结构，并将其安全存放在动脉造影室。
动脉的安装
1. 通过在聚苯乙烯培养皿（Ø100 mm）中将一些胶带（5厘米）上下颠倒（粘稠的一面）准备好。将上下带的外端粘贴到聚苯乙烯盘上，并放上一些短片。
2. 使用立体显微镜在线盘（图3）中准备螺纹（Ø〜20μm;活体系统仪器）（见设备A5）。螺纹由1）弯曲直线，并通过将外端彼此交叉而形成一个圆，2）将一个外端两次穿过圆圈。
  
  Figur e 3。用于安装 a n r t的尼龙线的制备 e r y A.程序所需材料概述10厘米聚苯乙烯培养皿（I），带有Durapore带和8-10毫米长的尼龙线（Ø≈20微米：箭头）; 2杜蒙钳（II）和尼龙线（III）。 B-F。近距离的带有尼龙线的Durapore胶带展示了螺纹准备的逐步程序; B.线程旁边的单线程（绿色箭头）;曲线直线，并通过相互穿过外端做一个圆; D.使用胶带的粘性将一个外端放在圆（直径500-700μm）内，使其保持在适当的位置;一个外端穿过圆圈; F.通过重复步骤D和程序E线程就绪。将完成的线圈放在粘性Durapore上的一半，并将其一半放在胶带上以改进处理（螺纹是可见的并且不使用立体显微镜可分级）。
3. 用70％乙醇（1x冲洗）和HBSS（2x冲洗）小心清洁家用（也可商购）的动脉灌注腔（图4A）的内部和移液管，将两个移液管上的三向标签连接到雌性Luer-Couplers，并用CaCl 2和MgCl 2（pH 7.4）填充HBSS培养基。确保两个移液器完全无空气，并留下1毫升注射器，填充介质，连接到腔室长度调节器侧面的3向接头。
4. 将新鲜分离和清洁的颈动脉转移到灌注室，并将其置于立体显微镜（见设备A5）（见图4）。
  
  图 ure 4。小鼠颈动脉动脉。 A.具有纵向长度调节器的灌注室（绿色箭头）的示例; B.使用HBSS填充干净的灌注腔，并在两个移液管上连接3路标签（I）。使用装有HBSS的1ml注射器（II）从移液管中取出任何空气。 C.使用立体显微镜观察灌注室的内部; D.用2个预先制备好的尼龙线将玻璃移液管关上，滑过它; E.安装但未加压动脉的概况。每个移液器使用两个螺纹。分岔（III）有助于确定正确的流向。 F.然后将安装的动脉在流出口（分叉侧）关闭并连接到流入口侧的血压计（IV），以显示所安装的动脉的任何泄漏。 G.逐步增加压力并校正两个移液管之间的距离（使用调节器，绿色箭头），直到动脉在80 mmHg处直线。注意步骤E中的动脉与程序G之间的长度差异，其中80mmHg的加压动脉长约30％。
5. 使用立体显微镜将两个或三个线放在移液管上（见设备A5）。
6. 将颈动脉的共同部分通过将其移动到腔室长度调节器侧的移液管上（不要太远！）。
7. 拧紧两个或三个螺纹，使得动脉固定在玻璃尖端和螺纹之间。
8. 通过颈动脉轻轻冲洗一些介质，以消除可能的血液残留物。
  注意：优选冲洗腔内的动脉，而不是总共冲洗鼠标，以限制内腔中的空气。
9. 使用室外调节器调节两个移液器之间的距离（图4B;绿色）。
10. 在2 ^nd移液器上放置两条或三条线。
11. 将其拉出移液管（图4B）将颈动脉的分叉侧安装。确保您已收紧所有未插管的分支，以创建闭路电路。
  注意：确保将动脉沿其生理方向安装用于流量测定，即流动从普通到分叉。流动方向的失败将导致假阳性或阴性结果。还要确保由于动脉扭曲而紧张地安装动脉！
12. 打开出口侧（室的非长度调整侧）的3向接头，轻轻冲洗一些介质，以确定移液器是否打开（HBSS穿过动脉并从出口侧出来）并且动脉被安装稳定
13. 将血压计与3 x 1毫米硅胶管和一个母Luer连接器连接到腔室的长度调节侧，并用一些HBSS填充压力计的3 x 1 mm管道。
14. 调整3路连接器以创建可以使用压力计进行压力控制的闭路电路，并使用外部调节器调节展开容器的长度，逐步增加平均管腔内压力，直到达到100 mmHg。通过跟踪连接到血压计的3 x 1 mm硅胶管中的介质水平，注意安装的动脉的泄漏。
  注意：在整个系统中的某处泄漏会导致3 x 1 mm硅胶管中的缓冲液水平发生变化！
15. 确保长度在100 mmHg下正确校正，然后将压力降低至80 mmHg（模拟动脉的生理伸展）。
16. 全部安装正确后，请继续下一步。
双光子激光扫描显微镜（TPLSM）
1. 将气候箱设置为37°C。确保气候箱内的温度传感器靠近物镜。要达到稳定的温度，气温控制箱必须大约启动。在第一次测量前1小时。这些实验不需要额外的CO 2/O 2/2气体控制。
2. 按照协议开启系统（每台显微镜不同）。
3. 将灌注室放置在显微镜平台上，并使用20x 1.00 WD物镜，荧光光源和RGB滤镜对焦于颈动脉。
  注意：注意不要过于深入，因为这样会导致样品，室的破坏和潜在的目标！
4. 选择所需的光谱通道（通道1：胶原为400-430nm;弹性蛋白为440-500nm;绿色细胞追踪器为510-540nm;细胞跟踪器深红色为620-670nm）。
5. 将激发激光（Ti：Sa）调谐至800 nm。
6. 选择成像模式（XYZ），扫描速度（200-400Hz）和xyz分辨率（XY-像素格式根据奈奎斯特标准，Z步0.8-1.5μm）。要在流动/细胞粘附过程中创建动脉影像，请选择XYT或XYZT扫描，选择"最小化"时间间隔并最大化总体记录时间。此外，减少像素数量并将扫描速度提高到600Hz，以便具有合理的图像刷新率。
7. 在"活"模式下选择颈动脉颈部感兴趣的区域;避免玻璃移液器旁边的第一个视野，因为这个区域由于安装协议而受到机械损坏！
  注意：找到血管的最简单的方法是集中在将动脉收紧到移液管上的螺纹上。线程将显示非常明亮（自动荧光），并且通过查看循环，可以得出焦点是否位于动脉的顶部或底部。
8. 选择Z范围（成像体积的总厚度）。
9. 使用'record'功能启动所选扫描。
10. 记录所需的数据集数量。
11. 当准备好成像时，请确保重命名并保存生成的数据。
12. 将数据复制到其中一个处理计算机。
13. 根据TPLSM协议关闭。不要忘记荧光灯泡和气候室！
  他在这里描述的TPLSM设置应该仅仅作为一个例子被认为是。 TPLSM系统的设置在系统的布局上强烈地专门为每一个不同的系统！尝试实现 > 频道）。
、
LDL渗透性的静态实验（图5）

图 ure 5.流程实验和静态实验的实验设置示意图
1. 安装步骤后，再次降低管腔压力，并打开出口侧的3路标签。
2. 卸下入口侧的3路连接器。
3. 从移液器的入口Luer连接器（使用填充有HBSS的1 ml注射器，14 G针）取出任何空气。
4. 缓慢注射装有50μg/ml Dil-LDL的血管，使用1ml注射器在HBSS中稀释。
  注意：DiI是连接到LDL的荧光亲脂性示踪剂，具有549nm的激发和565nm的发射。
5. 使用血压计将动脉重新加压至80 mmHg。
6. 将血压计放在气候箱的顶部，并在成像时保持眼睛。压力下降意味着系统不完全关闭，因此泄漏。
7. 将安装的动脉放置在气候箱内的显微镜平台上。
8. 在37°C孵育90分钟。
9. 用HBSS清洗血管以清洗无限制的LDL（与前述Dil-LDL注射相似的程序）。
10. 注射抗CD31 eFluor450抗体（标记内皮细胞，更具体地说是内皮结）：与以前描述的Dil-LDL注射相同的程序。
11. 在37°C孵育10分钟。
12. 用HBSS清洗血清以洗去未结合的抗体（与前述Dil-LDL注射相似的步骤），再次加压并将其置于显微镜载物台上。
  注意：在立体显微镜的帮助下，冲洗或装载容器最好在气候室外进行。
13. 开始录音（见上文图像采集部分）。
14. 分析渗透性时，需要系统地扫描整个动脉！保持视野（f.o.v.）尺寸和扫描体积相等，并通过动脉逐场移动，直到达到其他移液管。
  注意：丢弃最后一个f.o.v.最靠近移液器由于安装程序而导致潜在的损坏。
15. 在使用处理软件记录的xyz扫描实验后进行LDL摄取的定量（图6）替代方案：任何能够处理多维数据集的图像处理软件就足够了。
  注意：当使用f.o.v时，可以从一侧可视化整个动脉的大约25％。 450×450μm，当从外膜到内腔扫描时，直到两个血管壁边缘从视野消失（参见图6C为扫描体积的印象）。如果需要对动脉的总体概况，则可以通过同时转动移液管（小心！）以90°，180°和270°的方式将颈动脉机械地转动。不建议通过动脉直接聚焦到"底部"，因为这将大大降低图像质量，并增加深度/摧毁样本的聚焦风险。
  
  图 ure 6。来自两种类型的（绿色 ;野生型白细胞，红色;敲击）的骨髓TPLSM成像实例衍生白细胞粘附在流动测定之后，颈动脉中出现白细胞）。 B. XY投影; C.三维重建和D.YZ投影的单一视野。使用自发荧光和二次谐波产生的固有信号可视化动脉壁细胞外基质组分胶原（亮蓝色，外膜）和弹性蛋白（蓝色，中膜）。比例尺=100μm
细胞募集的动态（流）实验（图5）
1. 使用10ml注射器，公Luer连接器，3向接头，3 x 1毫米硅胶管（1米）和母Luer连接器（1毫米）将流动室与颈总动脉侧连接到注射器泵从注射器到连接到腔室的3路连接器）。泵可以放置在气候室的顶部或旁边，并应稍微倾斜以确保注射器完全清空。使用一些额外长度的3 x 1毫米硅胶管（1米），并在气候室内（带有新加坡胶带）进行回路，以便将介质或细胞悬浮液预热至37°C，然后到达动脉。
2. 确保整个系统无空气充满HBSS，然后再将其连接到动脉！
3. 使用另一个三向接头和3 x 1毫米硅胶管将容器/腔室的出口侧连接到水柱。确保水柱充满HBSS并且位于正确的高度（黑线）。使用连接到夹具上的50ml管和位于动脉位置80厘米高处的柱以收集"冲洗"的液体。将3 x 1毫米硅胶管粘贴到猎鹰，以稳定硅胶管进入50ml管的位置。
4. 在泵上选择合适的流量（参见手册）。确保选择正确的注射器（尺寸和品牌），流动方向（推动）和总体积（5.5 ml，取决于实验）。
5. 为了模拟动脉血流速率，将泵设定为0.54ml/min（基于流速和平均颈动脉直径计算我 v o ）
6. 以适当的方式打开三向选项卡，并用介质执行测试运行，以检查打开的流量系统。液体应慢慢从3×1毫米硅胶管中滴入水柱上的50ml管中
7. 更换注射器与类似的包含预先准备好的细胞悬液混合物。使用14 G针和HBSS填充的1 ml注射器，使Luer连接器和3向接头空气畅通。使用总体积为6ml的细胞悬浮液混合物，其允许10分钟的流动时间。
  确保每次更换注射器时，气泡将不会引入到系统中，因为气泡会或破坏动脉内皮细胞！在重新连接注射器或3号注射器之前，请仔细取出空气/填充Leur连接器的外端，使用HBSS（使用1 ml HBSS注射器和20 G针头）方式标签。同时确保硅胶管在将其连接到室之前已正确填充HBSS。
8. 设置图像采集设置时，启动流程。
9. 当需要流式测定的实时记录时，启动xyzt扫描。
  ote：粘合细胞将是圆形的，由于TPLSM的激光扫描方法，流明的细胞将显示为条纹。
10. 一旦细胞悬浮液用尽，用含有HBSS的注射器代替细胞悬液注射器，再次开始流动3分钟（或约2毫升）。后者是为了避免在泵侧的硅胶管的死体积中的细胞损失，并减少腔内空间中的非粘性细胞的数量。
11. 对于静止的xyz图像（图6），停止泵。
12. 分析细胞募集时，需要系统扫描整个动脉！保持视野（f.o.v.）大小和扫描体积相等，并通过动脉逐场移动，直到您到达其他移液器（丢弃最接近移液器的f.o.v.）。
13. 粘附细胞的计数可以直接进行（扫描通过动脉;需要2名观察者，总是记录一些参考的xyz扫描），或者在使用处理软件（Leica LasX）的记录的xyz扫描中进行实验（图6） />
14. 重复来自安装在2号动物造影腔室中的2只雄性供体（野生型或敲除小鼠）的颈动脉的整个过程。
  减少实验时间和容器室属性的影响，最好设置下一轮 e 具有交替频率（即，使用2 ^nd鼠标类型作为最初使用的房间中的第一个）的实例替代应用的细胞标记用于染色分离的白细胞亚群（即，在下一系列实验中绿色变为红色）。 />

数据分析

Dil-LDL外渗分析
1. 使用Leica LASX 3.11软件对每个细胞的连接Dil-LDL颗粒的数量和大小进行定量。
  注意：使用多维分析的任何图像处理软件都可用于此方法。
2. 将记录的xyz堆叠重新组合成最大强度投影，将3D信息转换为显示xy平面中的所有细胞结的所得2D图像（图7A）。
  
  Figu re 7。 STRONG>。 A.最大图像显示XY投影（Dil-LDL为红色，CD31为蓝色）。使用自发荧光和二次谐波产生的固有信号可视化动脉壁细胞外基质组分胶原（白色，外膜）和弹性蛋白（绿色，中膜）。图像还包括显示ROI选择（红色箭头）的分析方法。刻度棒=50μm。 B.强度方案的示例，显示表示Dil-LDL颗粒的各个峰。
3. 使用模糊滤波器（内核大小3）实现了背景噪声的进一步降低。
4. 通过临时排除代表Dil-LDL颗粒的光谱通道，基于连接的CD31信号选择十个单独的内皮细胞，并从LDL信号中盲目。
5. 基于其CD31连接染色，围绕每个所选择的细胞绘制折线，导致每个单独细胞的特定的感兴趣区域（图7A，红色箭头）。
6. 折线选择用于产生强度分布图（图7B）
7. 将Dil-LDL通道的阈值设置为高于背景强度以排除背景噪声。
  注意：具体的阈值水平将根据实验背景水平而有所不同，必须单独确定。
8. 强度分布中单个峰的总数表示颗粒数，每个峰的全宽用于估计连接的Dil-LDL颗粒的大小。
  任何细胞结。

食谱

裂解缓冲液
155mM NH 4 Cl
10mM KHCO 3
0.1mM EDTA
溶于1L水（MilliQ），pH7.2

致谢

研究由DFG（SFB1123 TB Z01，A01和B03以及INST409/97-1 FUGG）和亚历山大·冯·洪堡基金会提供财务支持。

参考

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