材料和试剂

成年老鼠（C57BL/6J，通常8-14周龄）
氯胺酮（Daiichi Sankyo Propharma，Ketalar for肌内注射500mg）
赛拉嗪（拜耳，Serakutaru 2％注射）
抑菌生理盐水（大冢制药，20ml安瓿）
70％乙醇
用于确认SCN损伤
1. 冰醋酸
2. 0.2％甲酚紫罗兰醋酸溶液（参见食谱）
3. 滤纸

设备

注意：有关本协议中使用的设备，请参见图1，图2，图3

立体定位框架（NARISHIGE，型号：SR-6M-HT）
立体定向显微操纵器（NARISHIGE，型号：SM-15R/L）
宽幅解剖显微镜（ZEISS，型号：Stemi 2000），带有吊架
冷光源（ZEISS，型号：CL 1500 ECO）

图1.设备列表1-4
辅助耳杆（NARISHIGE，型号：EB-5N）
剪刀（例如，，Fine Science Tools，目录号：14068-12）
Scalpel（FEATHER安全剃须刀，目录号：No.11）
缝合线的手术针（例如，NATSUME SEISAKUSHO，目录号：C21-40）
止血剂（例如，，精细科学工具，目录号：13008-12）
镊子（例如，，Fine Science Tools，目录号：11009-13或11008-13）
带针的结核菌素注射器（例如，Terumo Medical，目录号：SS-01T和NN-2719S）
剃刀（例如，，FEATHER安全剃刀，目录号：FAS-10）
棉签（例如，，Q-tip）
加热垫（例如，，宠物电加热垫）
带雕刻刀的手钻（DREMEL，型号：106）

图2.设备列表5-15
损伤装置（Ugo Basile，目录号：53500）
电极（100μm，涂有环氧树脂，除了尖端的200μm，Neuroscience）
用鳄鱼夹插入连接器电缆
带有用于确认SCN损伤的红外探测器的区域传感器（EK，目录号：PS-3241）

图3设备列表16-18

软件

ClockLab软件

程序

该协议基于颅骨表面（粗糙和λ）上的结构特征作为确定目标位置的参考点（图5）。 Bregma和lambda分别定义为矢状缝合与冠状和羔羊皮缝合线的交点。小鼠脑图谱（例如，Paxinos和Franklin，2001）允许通过测量这些头骨特征来确定脑结构的前后，内侧和外侧 - 腹侧坐标。

麻醉老鼠

用溶解在抑菌盐水中的氯胺酮（7mg/ml）和赛拉嗪（0.44mg/ml）的混合物腹膜内注射（20μl/g体重）麻醉小鼠。动物应在5-10分钟内达到手术麻醉。在鼠标达到完全麻醉后，刮去头骨顶部的毛皮。
注意：通过角膜眨眼和尾部反射来评估麻醉深度。等到反射消失时，如果鼠标没有被麻醉。麻醉应持续约1小时。

将鼠标安装到立体定位框架（视频1）

Video 1. Procedure of setting mouse to a stereotaxic frame. This video describes how to mount a mouse to a stereotaxic frame. The videoclip begins with insertion the auxiliary ear bar into the external auditory meatus.

将鼠标安装到立体定位框架之前，请插入辅助耳杆。将辅助耳杆的尖端引导到外耳道内并拧紧螺丝。
注意：当尖端正确插入鼓膜时，会听到小声的声音。确保辅助耳杆和鼠标的中线垂直放置。
将立体定位框架的耳杆插入辅助耳杆。锁紧耳塞。正确完成后，动物的头部应以耳杆对称调整为中心。
将门牙滑入口中，将门牙放入孔中。向下施加向下的压力，同时将门牙杆向后滑动直至停止。牢固地拧紧鼻钳和门牙杆（图4）

图4.安装在立体定位框架中的鼠标

手术（Video2）

Video 2. Stereotaxic surgery. The video shows steps for the surgery.

注意：为了维持体温，建议在手术过程中将鼠标放在加热垫（38°C）上。

用70％乙醇消毒头皮，并用手术刀沿中线切开。露出头骨，用棉签擦去颅骨组织。
将立体定位显微操纵器安装在立体定位框架上并附着电极。
通过降低电极尖端直到接触颅骨，进行前凸和鼻窦的背侧测量。然后，调整门牙栏，使两个粗线和lambda线都处于相同的水平位置（图5）。
注意：在这一点上，确保bregma和lambda都在中线。如果这些不在中线，则需要在立体定位框架上重新安装鼠标。

图5.小鼠颅骨的背表面。 Bregma和lambda分别定义为矢状缝合与冠状和羔羊皮缝合线的交叉点。
使用解剖显微镜，在正前方设置为零。将电极设置为目标坐标：对于成年C57BL/6J小鼠，尾部到尾标为0.2mm，中线为0.23mm。用骷髅上的铅笔标记目标。
在两个目标的标记目标上通过头骨钻两个小钻孔。将成年人C57BL/6J小鼠的电极放入颅骨表面5.9毫米以下的孔中。如果在钻孔后观察到出血，请用棉签向整体施加压力来停止出血。
注意：正确的目标坐标将根据鼠标的年龄或应变而变化。可能需要引导手术来完善目标坐标。

设置病变制造装置
1. 将电极连接到连接柱（+）上。用插头连接器电缆的一个夹子夹住鼻夹，并将其连接到装订柱（ - ）。用鼠标尾部夹住插头连接器电缆的另一个夹子，并连接到装订柱（G）（图6）。
  
  图6.病毒制作设备与鼠标的连接
SCN病变
1. 使用病变制造装置输送0.8 mA的电流3秒。对于假手术，请使用相同的外科手术，但不提供电流。
2. 使用手术针和螺纹去除电极并缝合切口（视频3）。从立体定位框架和辅助耳杆上取下鼠标。
3. 在恢复期间（约30分钟），将加热垫（38°C）上的鼠标温热。
  
  Video 3. Suture of incision. This video provides a demonstration of suture of the incision in the end of surgery.
确认SCN病变
为了确认由SCN病变引起的心律失常，使用具有红外检测器的区域传感器在恒定黑暗中监测自由移动活动的节律（图7）。活动节奏可以使用ClockLab软件进行分析。 SCN病变也可以通过使用甲酚紫溶液的SCN切片的Nissl染色来确认（图8）。

图7.红外探测器设置示意图

图8. SCN病变的确认显示SCN损伤后1个月（左图）和双重绘制的活动图（右图）的小鼠的代表性Nissl染色的冠状脑切片的SCN损伤的小鼠（上图）和假手术的一个（下图）。在Nissl染色（左图）中，双侧SCN在SCN损伤的小鼠（上图）部分丢失，而假手术小鼠部分的SCN（箭头）完整（下图）。电解损伤常常导致组织碎片的形成（箭头）。 3 V，第三脑室。 OC，视交叉。刻度棒= 500μm。当在恒定暗（DD）条件下监测活动时，SCN损伤的小鼠显示心律失常运动行为（上图），而假手术小鼠显示正常的昼夜节律。活动图上的阴影区域表示黑暗时期。（数据来自Shimizu等人，2016）。

数据分析

活动节奏分析：ClockLab软件自动收集和分析数据。卡方周期分析用于评估节律性。如果SCN损伤手术成功，则在24小时期间内不会检测到周期图峰值（定义为统计显着性水平 <0.05）。

笔记

整个手术方案每只动物需要约30分钟。
确保准确度最重要的一步是将鼠标的头部正确安装在立体定位框架上。

食谱

0.2％甲酚紫醋酸溶液

溶解2.0克甲酚紫990毫升蒸馏水
加入10毫升冰醋酸
用蒸馏水补充1000毫升，搅拌1小时
通过滤纸过滤溶液

致谢

这项工作得到了日本教育，文化，体育，科技部科学研究资助。

参考

Paxinos，G.和Franklin，KBJ（2001）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://braininfo.rprc.washington.edu/Source.aspx?ID=263&questID=1"target = "_blank">立体定位坐标中的小鼠脑，Atlas的豪华版。学术出版社。
Shimizu，K.，Kobayashi，Y.，Nakatsuji，E.，Yamazaki，M.，Shimba，S.，Sakimura，K。和Fukada，Y。（2016）。 SCOP /PHLPP1β调节昼夜节律-term识别记忆。 7：12926.