材料和试剂

对于这两种方法
1. 1.5ml微管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
2. 0.2μm醋酸纤维素膜过滤器（Sartorius，目录号：11107-47-N）
3. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：16104）
4. MilliQ质量水（MQ）
5. 碎冰
6. 在大肠杆菌中过表达的室内实验室纯化的C末端His标记的麦芽糖酶MAL1（来自多形态Ogataea多形核霉素）及其无活性突变蛋白（Asp199Ala）（如Viigand 等，，2016）
对于古典活动分析
1. 特殊PS（聚苯乙烯）微型光度计比色皿，2ml（LP ITALIANA，目录号：112117）
2. 葡萄糖液色试剂盒（GOD-PAP方法，葡萄糖酶比色法）（人类，目录号：10260）
3. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：795488）
4. 磷酸氢二钾（K 2 O 3 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：RES20765）
5. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
6. Tris碱（Roche Molecular Systems，目录号：10708976001）
7. 盐酸37％（HCl）（AppliChem，目录号：A0659）
8. 1M Tris-HCl缓冲液（pH 8.3）（参见食谱）
9. 麦芽糖酶缓冲液（参见食谱）
对于Thermofluor方法
1. LightCycler ^® 480具有密封箔的多孔板96（白色）（Roche Molecular Systems，目录号：04729692001）
2. 5,000x SYPRO橙蛋白凝胶染色剂（Sigma-Aldrich，目录号：S5692）
3. HEPES缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
4. 氢氧化钠（NaOH）（AppliChem，目录号：131687.1211）
5. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：31434-M）
6. 0.5 M HEPES缓冲液（pH 7.0）（见配方）
7. 4x Thermofluor缓冲液（见配方）

设备

药物平衡PS2100/C/2（RADWAG天平和秤，型号：PS 2100/C/2）
JENWAY pH计型号3510（Cole-Parmer仪器，型号：Jenway 3510）
移液器（Fisherbrand ^TM Elite Pipette Kit）（Fisher Scientific，目录号：14-388-100）
冰箱冷柜（伊莱克斯，型号：EN2900AOW）
Ultrospec 3100 pro紫外/可见分光光度计（GE Healthcare，Amersham Biosciences，型号：Ultrospec 3100 pro，目录号：80-2112-37）
ThermoBlock TDB-120（Biosan，型号：TDB-120）
数字计时器/时钟（Fisher Scientific，目录号：S01619）
用于微量滴定板的板式密封刮刀（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：5701）}
LightCycler ^® 480仪器II（Roche Molecular Systems，型号：LightCycler 480仪器II，目录号：05015278001）
将4K-15（Sigma Laborzentrifugen，型号：4K-15，目录号：10742）与4个桶的摆出转子（Sigma Laborzentrifugen，目录号：11150）和用于微量滴定板的桶，铝（Sigma Laborzentrifugen，目录号：13220）

第一部分经典的热稳定性测定

注意：麦芽糖酶的经典热稳定性测定是基于在各种温度下孵育后酶的残留催化活性的测定。因此，我们首先提供麦芽糖酶活性测定方案

程序

麦芽糖酶活性测定法：方法的原理
Ogataea（Hansenula）polymorpha的Maltase（MAL1）在许多二糖和三糖中水解α-糖苷键（图1A），通常每分子的裂解底物释放一分子葡萄糖。在一些底物的情况下，例如麦芽糖和异麦芽糖，产生两个葡萄糖分子。通过根据葡萄糖的释放监测底物水解的初始速度，在选定的温度（我们常规使用37℃）测定麦芽糖酶活性。这里描述的方法是Hackel（1975）用于测定面包酵母中的转化酶活性的方法的修改，并且也被我们用于Viigand等人，2016中。在本文提出的方案中，蔗糖用作酶的底物。 MAL1的蔗糖水解反应的K 约为25mM（Viigand等人，2016）。我们使用两倍高浓度（50mM）的蔗糖进行麦芽糖酶活性测定。使用市售的葡萄糖液色试剂盒测定从麦芽糖酶反应中释放的葡萄糖的量（图1B）。
标准反应混合物（总共1ml）含有麦芽糖酶缓冲液（参见食谱），50mM蔗糖和3.6μg麦芽糖酶蛋白质。使用固定化金属亲和层析纯化麦芽糖酶。我们的数据显示，蛋白质的催化活性在4℃储存数月后不会降低。

图1. MAL1底物的示意图，它们预期与酶（A）的结合和通过用葡萄糖液色试剂（B）测定释放的葡萄糖的麦芽糖酶测定。A.单糖组成和连接类型 0。指出多发性硬化症麦芽糖酶底物及其预测与麦芽糖酶蛋白质-1，+1和+2的结合。二 - 或三糖底物的非还原性末端的葡萄糖残基被认为在-1个位点处结合。在-1和+1位上结合的残基之间进行通过麦芽糖酶切割糖苷键，从而将水解产物释放到反应介质中。背景上的箭头显示酶对所描绘的底物的亲和力的增加。该图基于Viigand等人的图1。（2016）。 B.使用葡萄糖液色反应的麦芽糖酶活性测定方案。从麦芽糖酶底物（例如蔗糖）释放的游离葡萄糖（绿色圆圈）被葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。过氧化物酶使用过氧化氢在苯酚存在下氧化4-氨基安替比林至红紫色醌亚胺。在500nm波长处测量醌亚胺的吸光度。在葡萄糖液色测定中测量的产品的颜色也显示在表1中（参见比色杯）。
1. 将850μl麦芽糖酶缓冲液和50μl（3.6μg）麦芽糖酶蛋白（适当稀释在麦芽糖酶缓冲液中）的两个平行样品（两个重复）在1.5ml微管中在温度调节（图2）上预温育5分钟37°C加热混合物。
  注意：实验过程中麦芽糖酶蛋白质储备溶液应保持在冰上。
  
  图2. Biosan热块
2. 通过将100μl500mM蔗糖储备溶液（在麦芽糖酶缓冲液中）加入缓冲液和麦芽糖酶蛋白质的预热混合物中开始反应，混合并开始计时。根据需要的时间进行孵育（通常为2至20分钟，取决于麦芽糖酶蛋白的催化活性），并且在反应期间的每个时间点从每个管中取出两个平行的样品（50μl）。在具有高催化活性的麦芽糖酶制备的情况下，采样应当例如在从反应开始起2,4,6和8分钟。
  注意：应测量反应的初始速度 - 意味着释放的葡萄糖的量在反应时间内应线性增加。如果反应减慢，应重复测定麦芽糖酶活性。在反复实验中，我们建议使用较少量的麦芽糖酶蛋白。
3. 将从反应混合物中取出的50μl样品移液到含有150μlpH 8.3的200mM Tris-HCl缓冲液的150μl终止液的1.5ml微量管中，并在96℃加热5分钟。注意：制备1M Tris-HCl缓冲液显示在食谱部分1中。在MQ水中稀释得到200mM缓冲液。//
4. 停止的反应样品在冰上冷却
5. 将800μl葡萄糖液色试剂加入每个停止的样品中，并用手彻底摇动。
6. 将带有样品的微管在37℃下用敞开的盖孵育5分钟。由于葡萄糖转化为醌亚胺，溶液变紫色（图1B）
7. 紫色醌亚胺的吸光度使用分光光度计在距离参考（空白对照）500nm波长的分光光度计下，使用路径长度为1cm的特殊PS微量光度计比色皿（表1，右图）测量。注意：
  1. 为了参考，将900μl麦芽糖酶缓冲液与100μl500mM蔗糖混合。从该混合物中取出50μl，并与150μl终止溶液和800μl葡萄糖液色试剂混合，并在37℃下用开放的盖孵育5分钟。
  2. OD 500测量的最合适的范围为0.1至1.0，其确保OD 500测量与溶液的葡萄糖浓度之间的线性。
麦芽糖酶热稳定性分析
1. 将50μl麦芽糖酶蛋白质制剂加入到850μl麦芽糖酶缓冲液（终浓度为0.0036mg/ml [3.6μg/ml]的麦芽糖酶蛋白质）中。每个研究温度应至少重复一次样品。
2. 将混合物（900μl）在各种温度（在该实验中在30℃至50℃）下在热块上温育30分钟。
3. 热处理后，样品在冰上冷却注意：我们建议在进行进一步分析之前收集所有热灭活的样品（保持在冰上）（参见下一步）。
4. 将冷却的样品在热块上温热至37℃（〜5分钟），并通过加入麦芽糖酶底物（100μl500mM蔗糖;反应混合物中的最终浓度为50mM）开始反应。 >
5. 按照步骤A所述继续进行：Maltase活性测定，步骤3

数据分析

麦芽糖酶活性分析
根据以下公式计算麦芽糖酶活性（E）：OD 500（1分钟）/（εx [c]）。 OD 500（1分钟）是在500nm波长下测量的每1分钟反应混合物的吸光度（光密度）变化; [c]是反应混合物中麦芽糖酶蛋白质的浓度（mg/ml）（参见步骤B1），（ε）是从葡萄糖校准曲线取出的消光系数（参见注释：葡萄糖浓度测定的校准曲线）。 br /> 麦芽糖酶活性表示为每毫克蛋白质每分钟水解的麦芽糖酶底物的量（以当前实例为单位的μmol）（蔗糖）。活性表达为μmol/（min x mg）或U/mg。
注意：如果两个葡萄糖分子由于麦芽糖酶底物的水解（例如麦芽糖或异麦芽糖;图1A）而释放，则根据葡萄糖产生测量的活性应除以2。
计算示例：

实验数据：

0.0036mg/ml麦芽糖酶蛋白与50mM蔗糖反应
在反应6分钟内每2分钟取出样品，停止，并使用葡萄糖液色法测定样品中的游离葡萄糖（参见表1第一列"OD 500"）。 /> 注意：在采样时间（6分钟）内，反应速度保持不变（参见表1，第三列"OD 500"[1分钟]）。 >

计算：

平均OD 500/1分钟为0.731/6 = 0.122。
0.292用作消光系数（ε）（参见注释：葡萄糖浓度测定的校准曲线）。
麦芽糖酶活性E = 0.122 /（0.292×0.0036）=115.9μmol/（min x mg）或115.9U/mg。
1分钟内，115.9微摩尔的蔗糖被1毫克的麦芽糖酶蛋白质水解
表1.麦芽糖酶活性计算示例

麦芽糖酶热稳定性分析
酶的解链温度（℃）认为是30分钟孵育后其催化活性降低50％的温度。计算出的麦芽糖酶蛋白质的T 约为44.4℃（图3）。

图3. O的热稳定性。多形态麦芽糖酶MAL1根据残留催化活性进行评估。平均值和标准偏差由至少三次独立测量计算。

第二部分。

O的催化无活性突变体。在这个实验中使用多形核霉素麦芽糖酶MAL1，其中亲核试剂Asp199被Ala取代。该取代使得能够在其底物（参见图1A）的存在下研究MAL1的热稳定性，而没有连续的催化反应（Viigand等人，2016）。使用实时PCR设备，可在荧光染料SYPRO Orange的存在下逐渐加热期间在线监测蛋白质变性。染料结合蛋白质的疏水性氨基酸，由于加热而在蛋白质变性时暴露于其中。将荧光强度绘制为产生S形曲线的温度的函数（参见图5）。该曲线的拐点对应于50％蛋白质展开的温度。在该方案中，我们使用蔗糖作为配体糖来评估其对麦芽糖酶蛋白质的稳定作用。在Viigand等人中。（2016），我们使用了几种额外的潜在底物（例如麦芽糖，麦芽酮糖和帕拉金糖）和麦芽糖酶的抑制剂（例如，葡萄糖）来预测哪些底物和如何强烈地可能结合酶。

程序

在实验之前，将LightCycler 480的多孔板96在碎冰上或冷冻器中冷却。
在开始分析之前，应该将LightCycler ^® 480加热。
一个接一个地加入以下成分，混合物的最终体积为每个样品20μl：

注意：

所有储备溶液都溶解在MQ水中。
所有组分应尽可能快地混合，以减少蒸发。多孔板应保存在粉碎的冰上，防止光照。对照样品含有MQ水而不是蔗糖。

96孔板用LightCycler ^{®480多孔板96（白色）密封箔覆盖，并用刮刀将刮刀按压到每个孔中。}
将密封的板在10℃下离心30秒（冷冻离心机4K-15），200g×g。
注意：离心机的转子必须与类似的板平衡，例如与之前的实验中的一样。温和的离心去除气泡，并确保所有液体都留在井底。
用于热稳定性测定的程序是：LightCycler ^® 480 SW 1.5。

我们使用波长为465 nm的激发和580 nm的发射，如Layton和Hellinga（2010）
程序：熔化曲线;温度从25℃升至95℃;每1度升温30次进行荧光测量
实验大约需要45分钟

通过导出.txt文件来收集数据。原始数据的进一步分析在"数据分析"中有所描述

数据分析

Thermofluor实验数据分析

所有数据导出为.txt文件（图4）。

图4.保存在.txt文件（屏幕截图）中的Thermofluor实验的数据
使用Microsoft Excel进行进一步分析。在测定期间记录的每个孔的荧光发射值（F1，F2，F3等等）水平地复制在显示温度值（T1，T2，T3等）。）对应于各自的荧光（图5，上图）

图5.用于基于Excel的分析（上图）和说明性荧光与温度图（下图）的Thermofluor数据的组织。无催化无活性的麦芽糖酶蛋白在没有配体（无配体）的情况下逐渐加热，在300mM蔗糖存在下。将荧光信号绘制为温度的函数，以获得蛋白质的S形熔解曲线（图的下图）。当蛋白质开始展开时，样品的荧光增加。在蛋白质完全展开时观察到最大荧光强度。之后，如Boivin等人所述，SYPRO Orange信号由于染料 - 蛋白质解离而降低。（2013年）。酶底物蔗糖的存在使蛋白质的热稳定性提高了5.8℃，其熔解温度T m从59.5℃（无添加的配体，黄色显示）升至65.3℃（在存在蔗糖;蓝色显示）
尽管如图5所示，尽管蛋白质的T mI值可以粗略地从原始数据图中得出，但是在Niesen等人中描述的进一步的数据分析。（2007）和Boivin等人。（2013）需要更准确的T< m>确定。
为此，我们从Thermofluor测定中处理了原始数据，除去大部分荧光值，只保留与温度升高相对应的温度约为0.5°C。
然后从处理的数据计算一阶导数。一阶导数（m）表示为：

其中Δy是荧光强度的变化，Δx是对应于各荧光变化的温度升高变化
对应于一阶导数曲线的峰值的温度表示T 值。
图5中以及Viigand等人提供的Thermofluor T sub数据。（2016）使用后一种方法获得。

第三部分。比较基于活性的测定和Thermofluor方法

在我们在Thermofluor测定中测定的不存在糖配体的情况下，MAL1的催化无活性突变体Asp199Ala的T m是59.5℃。野生型（催化活性）MAL1的相应值为51.0（Viigand等人，2016）。因此，无活性突变体比野生型酶更稳定。使用基于经典活性的测定法确定的野生型MAL1的T sub亚基是44.4℃（图3）低于从Thermofluor测定中检测到的T sub。如本文所述，在经典的热稳定性测定中，蛋白质在30分钟内在选定的温度下加热，之后测量残留的催化活性。在Thermofluor测定的情况下，蛋白质逐渐加热（1.5℃/分钟），随后在线监测变性。这些数据表明，麦芽糖酶蛋白耐受短期逐渐加热比延伸逐步加热。当在酶底物存在下使用Thermofluor测定麦芽糖酶突变体Asp199Ala时（参见本方案的图5和Viigand等人，2016）或抑制剂（Viigand等人，，2016），蛋白质的T m 增加。

笔记

葡萄糖浓度测定的校准曲线
1. 获得的值如图6所示。
  
  图6.使用葡萄糖液色试剂盒进行葡萄糖浓度测定的校准曲线在500nm波长下测量不同葡萄糖浓度的喹啉酮形成：0mM，1mM，2mM，3mM，4mM， 5mM和5.55mM。
2. 在麦芽糖酶活性计算中，图6的线性趋势线（功能：Set Intercept和Display方程）的斜率作为消光系数（ε）用于计算麦芽糖酶反应中释放的葡萄糖的量。

食谱

1M Tris-HCl缓冲液（pH 8.3）

将24.228g Tris碱溶于150ml MQ水中
用37％HCl调节pH至8.3
用MQ水完成200毫升，通过0.2微米醋酸纤维素膜过滤
在室温下存放

具有0.1mM EDTA的麦芽糖酶缓冲液-100mM磷酸钾缓冲液（pH6.5）

制备1M磷酸氢二钾（K 2 H 2 HPO 4）的1M储备溶液和磷酸二氢钾（KH 2 O 3 PO 4） sub>）在MQ水中的盐
在MQ水中制备0.5M EDTA溶液
对于400ml 100mM麦芽糖酶缓冲液（pH6.5），混合14ml 1KH 2 HPO 4（碱性组分）和26ml 1M KH 2/sub> PO 4（酸性成分）。使用相同摩尔浓度的预先计算量的酸性和碱性组分制备缓冲液以获得缓冲液的所需pH值（Gomori，1955）
加入80μl0.5 M EDTA
用MQ水完成400毫升
过滤通过0.2μm醋酸纤维素膜过滤器，并保存在4°C

0.5 M HEPES缓冲液（pH 7.0）

将5.96g HEPES溶于40ml MQ水中
用10N NaOH调节pH至7.0
加入MQ水至最终体积为50 ml
过滤通过0.2μm醋酸纤维素膜过滤器，并保存在4°C

4x Thermofluor缓冲液

在MQ水中准备0.5M HEPES储备缓冲液（pH 7.0）
在MQ水中制备5 M NaCl储液
混合800μl0.5 M HEPES缓冲液，120μl5 M NaCl和80μlMQ水，最终体积为1 ml
为每个实验准备新的缓冲溶液

致谢

这项工作由ERC授权GLOMR9072（ETF9072）和GLTMR1050P（PUT1050）资助。该方法的简要描述在Viigand，K.，Visnapuu，T.，Mardo，K.，Aasamets，A。和Alamäe，T。（2016）。 Ogataea（Hansenula）polymorpha的麦芽糖酶蛋白是酵母麦芽糖酶和异麦芽糖酶的复活祖先蛋白质ancMALS的对应物。酵母33（8）：415-432。感谢Dimitri Lubenets在Thermofluor测定中的帮助。

参考

Boivin，S.，Kozak，S。和Meijers，R。（2013）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23948764" target ="_ blank">使用Thermofluor筛选蛋白质纯化和表征的优化。蛋白质纯化纯化91（2）：192-206。
Gomori，G.（1955）。准备缓冲液用于酶研究。 Meth Enzymol 1：143-146。
爱立信，UB，Hallberg，BM，Detitta，GT，Dekker，N。和Nordlund，P.（2006）。用于结构研究的蛋白质的基于氟氟烃的高通量稳定性优化 Anal Biochem 357（2）：289-298 />
Hackel，RA（1975）。转化酶形成的遗传控制在酿酒酵母中。 I.影响蔗糖利用的突变体的分离和表征。 Mol Gen Genet 140（4）：361-370。
Layton，CJ和Hellinga，HW（2010）。热力学分析蛋白质热解折叠中配体诱导的变化应用于与外源荧光染料配体亲和力的高通量测定。生物化学 49（51）：10831-10841。
Lombard，V.，Golaconda Ramulu，H.，Drula，E.，Coutinho，PM and Henrissat，B。（2014）。 2013年碳水化合物活性酶数据库（CAZy）。 Nucleic Acids Res 42：D490-D495。
Niesen，FH，Berglund，H.和Vedadi，M。（2007）。使用差示扫描荧光测定法检测促进蛋白质稳定性的配体相互作用。 Nat Protoc 2（9）：2212-2221。
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