材料和试剂

β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
HBSS（Hyclone，目录号：SH30268）
硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B0252）
硼砂（Sigma-Aldrich，目录号：B9876）
半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）
EtOH
神经基础培养基（NBM）
Glutamax
B27
PenStrep
庆大霉素
谷氨酸
FBS
层粘连蛋白
台盼蓝
Na _{2 ₄}
K ₂ SO ₄
MgCl 2
CaCl <2>
葡萄糖
酚红
EDTA
0.1M硼酸盐缓冲液（pH 8.5）（参见配方）
解剖介质（DM）（参见配方）
木瓜蛋白酶激活缓冲液（参见配方）
木瓜蛋白酶（100mg）（Worthington Biochemical Corp，目录号：LS003119）（参见Recipes）
DNase（F.Hoffmann-La Roche，目录号：10104159001）（参见Recipes）
木瓜蛋白酶消化培养基（参见配方）
解离介质（参见配方）
用酚红电镀介质（参见配方）
不含酚红的生长培养基（参见配方）

设备

PDMS设备
显微镜
血细胞计数器
TC机罩
孵化器
-80°C冰箱
37°C水浴
6 cm细胞培养皿
等离子焊接机（型号PDC-32G， http://www.harrickplasma.com/）

程序

盖玻片和腔室准备
第1天：
1. PDMS装置如Park等人（2006）中所述制造。
第2天：
1. 康宁No.1或者1.5号眼镜都适合我们的显微镜（24 mm x 40 mm）。或者，Carolina coverglasses 24 mm x 50 mm。
  1. 在高压灭菌的ddH 2 O中对盖玻片进行超声处理60分钟。
  2. 在70％EtOH中再次超声处理30分钟
  3. 在100％EtOH中超声处理30分钟
  4. 在TC罩中用高压灭菌的ddH 2 O洗涤，在罩中将盖玻片空气干燥过夜。
第3天：
1. 使用等离子体粘合机组装盖玻片和PDMS装置
2. 用力按压角落，但只轻轻地触摸中间通道。用PDL（> 150Kmol wt，在硼砂硼酸缓冲液中制备）涂布室：
  1. 将0.5mg/ml PDL加入到装置一侧的孔中，并允许其流入连接孔（留下未填充的另一侧）。
  2. 允许PDL流过设备约10分钟，然后向孔中添加更多的PDL以填充它们。
  3. 将含有PDL的装置置于37℃的培养箱中至少30分钟，使PDL填充微型槽。
  4. 用PDL填充腔室另一侧的孔和主要通道，并将腔室在37℃下孵育至少4小时，优选过夜。
第4天：
1. 处理后吸出多余的PDL，但要小心，不要从设备中吸出所有的液体。
  1. 将高压灭菌的ddH 2 O加到装置两侧的每个孔中，并通过毛细管作用流到另一个孔。
  2. 吸出水（再次小心不要完全从装置中除去所有液体），然后向每个连接的孔中的另一个中再加入150μl高压灭菌的ddH 2 O 2并允许其流过对应井。
  3. 重复该快速洗涤两次，然后将含有ddH 2 O的装置在37℃的培养箱中放置1小时。
  4. 然后，重复洗涤步骤。用ddH 2 O 2每次至少洗涤装置三次，每次一小时，这是总量。
  5. 将具有必需因子的NBM（glutamax，B27，PenStrep）添加到顶部孔中。使其流过，在37℃孵育过夜。
  6. 准备40毫升电镀介质：
    800μlB27 +30μg/ml庆大霉素+400μlglutamax +25μM谷氨酸盐
  7. 在15ml管中预热10ml解离培养基：Neurobasal + 5％FBS +庆大霉素。
  8. 预热10 ml普通neurobasal介质为木瓜蛋白酶
第5天：
1. 向每个孔中加入层粘连蛋白（20μg/ml）并在37℃下孵育至少30分钟：用层粘连蛋白包被室：从-80℃冰箱中取出20μl等分试样并立即放在冰上，等待直到它完全溶解在冰上，然后加入冷的neurobasal媒体到1.8毫升。
  1. 打开紫外线灯，紫外线消毒一个6厘米的细胞培养皿15分钟。
  2. 在该6cm细胞培养皿中，37℃培养箱中预热14ml电镀培养基
  3. 在电镀细胞前1小时将层粘连蛋白溶液替换为电镀培养基
海马神经元的解剖
1. 在37℃下用750μl木瓜蛋白酶缓冲液活化木瓜蛋白酶10mg等分试样30分钟
2. 加入预热的neurobasal培养基，过滤除菌，然后添加一个DNase 20微升等分。
3. 在TC罩中用10ml冷的解剖培养基洗涤组织（洗涤两次）
4. 在组织通过重力沉降后，完全去除HBSS
5. 将一等份的DNA酶加入到10ml消化培养基（昨天预热）中
6. 将一半消化培养基（5ml）在37℃水浴上放置15分钟
7. 将剩余的一半消化培养基加入管中，并在37℃水浴下再孵育15分钟
8. 让组织通过重力沉降到底部或短时间旋转
9. 用5ml木瓜蛋白酶解离培养基重悬浮沉淀，用5ml移液管上下颠倒5次，避免鼓泡培养基。
10. 让碎片缓慢沉淀，或短暂旋转到100 g上下（600 rpm），将上清液转移到一个新的15毫升管。
11. 继续研磨未解离的组织5-10次，取上清液，并与前5毫升结合
12. 取10微升，并与10微升台盼蓝混合
13. 加载10μl混合物在血细胞计数器，并计数：
  16个小方格中的所有细胞×10 4个细胞/ml（来自12只E18幼崽的典型产量为〜50M）。
Amaxa转染
1. 在使用前，将82μl核转染液与18μl补充物混合
2. 准备50微升nucleofector与5微克总DNA（如果使用多于1质粒，混合等摩尔比）。
3. 在150×g下旋转5百万个（每个转染的1-6百万个）神经元5分钟。在纺丝期间，转移7毫升预热的电镀培养基到15毫升管，加入350微升FBS，保持在37℃。用尖头准备1ml移液器。
4. 旋转后，使用吸液管用200μl移液器吸头取出所有培养基
5. 将细胞重悬在50μlnucleofector溶液中
6. 混合50微升细胞与DNA + neucleofector的预混合物（总共100微升）
7. Zap与程序G-13（更好的Hc）或O-03（更好的Cx）。将形成死细胞泡沫。
8. 立即移液在1毫升加热的平板培养基中的FBS和移液管到1.7毫升eppendorf管。不要拿起死泡沫。温柔。
9. 救援后在37℃下孵育10分钟
10. 在150分钟，5分钟，150 /分钟下旋转细胞。
11. 用FBS重悬于300μl电镀培养基中
12. 加载5μl/孔，填充每个微流体的两个上部孔
13. 让细胞在37℃下粘附10分钟
14. 使用带有FBS的电镀培养基的两个移液管同时从两端填充孔
15. 2小时后将介质完全更换为新鲜的电镀介质W/O FBS
第6天：
1. 第二天早上用电镀介质再次更换介质。
2. 每2天更换一半介质。

食谱

0.1M硼酸盐缓冲液（pH8.5）（硼砂硼酸缓冲液） 1.24g硼酸
1.9克硼砂用ddH 2 O 2加到500ml/dm 2 PH应为8.5，无需调整
过滤灭菌
储存于4°C。
解剖介质（DM）（1L）
82ml 1M Na 2 SO 4 4·h/v 60ml 0.5M K 2 SO 4 4·h/v 5.8ml 1M MgCl 2·6H/v 252μl1M CaCl 2 8ml 2.5M葡萄糖（20mM） 1ml 1M Hepes（pH 7.4）
2ml 0.5％苯酚红pH用1M NaOH至7.4过滤灭菌并保持在4℃ 或者只是使用HBSS并加入葡萄糖至20mM，HEPES：
500ml HBSS与Ca 2+ 2 + 和Mg ^{2 +}
5ml 1.5M D-葡萄糖（过滤除菌）
5ml 1.0M HEPES pH 7.2
木瓜蛋白酶激活缓冲液（50ml）
1.1mM EDTA110μl（0.5M EDTA，pH8.0） 0.067mMβ-巯基乙醇0.25μl（0.0047μlBME/ml缓冲液） 5.5mM半胱氨酸33.25mg
储存于4°C。
Papain
等分到10毫克/1.7毫升埃彭道夫管，存储冻干粉在4℃
使用前加入750μl木瓜蛋白酶缓冲液
在37°C下活化至200 U/ml（10 x） - 30分钟（暂时摇动试管一次）
DNase
1000U /μl储液，20μl等分试样（20,000U /管，用于10ml）
木瓜蛋白酶消化培养基（每十只动物）
添加750微升激活的木瓜蛋白酶到纯神经基质培养基
过滤灭菌
添加DNase：2 U /μl DNase
解离培养基（10ml神经鼻）
庆大霉素40μg/ml
FBS 500μl
用酚红（在20ml神经鼻）中用血清培养培养基
B27400μl（Gem21，NS21同样）
庆大霉素40μg/ml（10mg/ml原液，取80μl/20ml培养基）
Glutamax 200μl
谷氨酸25μM（100mM储液，4,000x，5μl/20ml）（使用12.5μM终浓度可能更好：2.5〜3μl/20ml）
FBS 200μl
不含酚红的生长培养基（在20ml神经鼻中）
B27400μl（Gem21，NS21同样）
Glutamax 200μl

致谢

备选参考方案可以在与AXIS ^TM Axon隔离装置相关的Millipore网站上找到。解剖方案从在迈克尔林博士的实验室，儿科和生物工程系，美国斯坦福大学开发的协议修改。

参考文献

可以从 http://www.xonamicrofluidics.com/about.html 请求详细的参考协议。
Park，J.W.，Vahidi，B.，Taylor，A.M.，Rhee，S.W.and Jeon，N.L。（2006）。神经科学研究的微流体培养平台 Nat Protoc 1 （4）：2128-2136。