材料和试剂

显微镜载玻片（76 x 26 mm）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：10143562CEF）}
显微镜盖片用于共聚焦成像：18 x 18 mm，0.17±0.01 mm厚度（Hecht Assistant，目录号：41014509）
解剖针（钨，直径：0.75和0.35 mm）
圆形培养皿35毫米（Greiner Bio One International，目录号：627102）
2毫升微管（SARSTEDT，目录号：72.695.500）
无尘纸
玻璃棉
植物材料：开花拟南芥植物
十二烷基硫酸钠，钠盐（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：71729）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：71690）
乙醇（70％，80％）（Fisher Scientific，目录号：10428671）
周期酸（Sigma-Aldrich，目录号：375810）
指甲油
安装介质
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
乙酸（Merck，目录号：100063）
偏亚硫酸氢钠（Na 2 S 2 O 5 O 5）（Sigma-Aldrich，目录号：31448）
盐酸发烟，37％（HCl）（Carl Roth，目录号：4625.1）
碘化丙啶（PI）（Sigma-Aldrich，目录号：P4864）
水合氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：15307）
甘油（Carl Roth，目录号：3783.1）
阿拉伯胶（Sigma-Aldrich，目录号：51198）
改性假席夫碘化丙啶（mPS-PI）溶液（参见食谱）

固定解决方案
带有碘化丙啶（PI）的伪希夫试剂
水合氯解决方案
霍耶的解决方案

设备

立体显微镜（例如，Leica Microsystems，型号：Leica M60）
孵化器（例如，Eppendorf，型号：Thermomixer C）
钻石或碳化物笔（Sigma-Aldrich，目录号：Z225568）
共焦扫描激光显微镜，激光线561nm的共振扫描仪和适用于甘油浸渍的APO PL物镜20x（NA 0.7）和63x（NA 1.4）（徕卡微系统，型号：徕卡TCS SP5）
计算机理想地具有推荐的高端处理器，内存和图形环境（ http： /www.bitplane.com/systemrequirements.aspx ）。低端设置是可能的，但会导致处理速度较慢

软件

Imaris 8.3.1（ www.bitplane.com ，英国牛津仪器）
数据分析软件（例如，R， www.r- project.org ）

程序

样品制备
1. 从 A收集花蕾。在拟合阶段将顶端花序放置在玻璃载片上，并放入一滴无菌水中。
2. 用解剖针将立体显微镜下的雌蕊分离开。
3. 将雌蕊转移到具有3ml固定液的小培养皿（参见食谱）。
  注意：验证雌蕊是否完全浸没在固定液中。
4. 在这个阶段，您可以将样品保存在4°C至多1个月。
5. 假Schiff PI染色遵循先前公布的方案（Truernit等人，2008;吉田等，2014），并详细说明。
6. 将雌蕊转移到1ml的1％SDS，0.2N NaOH溶液的2ml微管中，在室温（RT）下进行过夜处理。
7. 弃去1％SDS，0.2N NaOH溶液，加入1ml 80％乙醇。在80℃下以350rpm孵育5分钟。
注意：以下步骤不需要温和旋转。
1. 取出80％溶液，在管中留下最少10μl。加入1 ml固定液。在室温下孵育1小时。
2. 用水冲洗组织一次，并在室温下在1％的高碘酸中孵育1小时
3. 用水冲洗组织一次，并在室温下在改良的假Schiff PI溶液（见食谱）（10μg/ml）中孵育1小时或2小时。
  注意：如果在眼睛检查下它们看起来很红，组织就会被染色。
4. 用水冲洗三次，加入300μl水合氯醛水溶液。在室内过夜进一步澄清。
  注意：将水合氯醛水溶液中的组织在室温下放置最多两天。
安装用于显微镜成像
1. 使用无尘纸清洁幻灯片和70％乙醇的盖玻片，让其干燥。
2. 使用金刚石尖笔，将5-6个小块（约3 x 18毫米每片）切成盖玻片（图1A和1B）。
3. 将一滴Hoyer的溶液或介质选择在两片玻璃盖玻片之间的幻灯片上，留下一个ca.宽度为10-12毫米
4. 将一个雌蕊放在落下（图1D）。
5. 将盖玻片放在顶部而不施加压力（图1E）。这对于保持雌蕊的三维结构非常重要
6. 用指甲油密封盖玻片的边框。将滑块置于水平位置，以使介质固化。
  
  图1.用于显微镜成像的样品安装。 A.清洁的盖玻片; B.用金刚石笔，将盖玻片切成小块; C.用两块作为支柱，在它们之间留一个空间; D.将雌蕊放在一滴安装介质中; E.将盖玻片放在上面并用指甲油密封其边界。
图像采集
1. 使用传输光或落射荧光（绿色激发滤光片，红色发射 - 长带通范围），使用20x物镜查找样品，然后切换到更高的放大倍率进行采集。
2. 设置图像采集参数
  1. 激发：561 nm
  2. 发射：570-616 nm
  3. 激光传输：30-40％。
    注意：这可能因激光类型/年龄而异。
  4. 检测：理想地是新一代检测器（例如，HyD），亮对比度增益模式。
    注意：优质图像的增益应在20％到30％之间。
  5. 扫描速度：共振模式，8,000 Hz。
  6. 针孔直径：1 AU（Airy Unit）。
  7. 平均帧：4.
    注意：如果荧光信号较低，激光传输/增益必须增加，则较高的平均值将提高图像质量 - 必须进行测试。
  8. 目标：理想的63x，计划+复消色差校正（PL APO），甘油浸没透镜（GLY），NA 1.4，工作距离（WD）0.3 mm。
    注意：将样品安装在甘油基培养基中;因此，甘油浸没透镜允许折射率最佳匹配。
  9. 图像格式：512 x 512像素。
  10. 图像尺寸：视野在80到85μm之间被裁剪得到x和y≈85nm。
    注意：这允许使用63×NA 1.3物镜在561nm（r x x，y z = 176nm，使用r x，y 0 = 0.4×x）进行2x过采样//NA）
  11. 设置z系列以捕获感兴趣的整个雌蕊/物体（例如，胚珠）。
    注意：根据胚珠发育的阶段，z系列范围为300至500个部分（分别为0.02至0.04 GB，分别为上述图像格式）。
  12. 将z步骤设置为〜80 nm。
    注意：这允许最终图像中的近似立方体素具有足够的过采样（奈奎斯特 - 香农定理）用于下游图像处理（去卷积或分割）。
3. 获取图像堆栈。
4. 保存数据集。不需要特定的文件格式。 Imaris可以从大多数显微系统读取文件。
  注意：我们强烈建议根据由分层数据库确定的序列号（例如Author_Initials_3或4digits，例如EM_023，EM_572等）来命名数据集。这允许轻松的数据集调用和批处理。
5. 立即更新自定义数据库中的图像描述。
  注意：我们强烈建议您制作图像数据库（例如Excel电子表格或其他专门程序），收集信息，如样品类型（生物材料，阶段，基因型，物种，染色批次等），图像类型和用户基于图像/染色质量的评估。这样可以有效地跟踪和处理用于下游处理的复制数据集。
3D重建和图像预处理
对于这里描述的Imaris的基本用法（3D视图，截面视图，创建轮廓曲面/创建蒙版），第一个用户可以参考免费在线教程（ http://www.bitplane.com/learning ）。
1. 在Imaris 8.3.1中上传一个文件。
  注意：Imaris Batch允许用户将lif文件中的所有系列转换为ims文件。
2. 使用"视图"选项卡中的"部分"模式检查图像的质量（图2和视频1）。细胞边界必须在所有维度上得到明确的解决（在XY，XZ，YZ面板中查看）。
  注意：xy（图像格式太低）或z尺寸（光学部分太少），安装和浸没介质中的不平衡信号采集和/或折射率，不稳定的荧光探针和/或陡坡信号损失的深度将产生图像，具有较低的信噪比对强弱分割的影响。
  
  图2.图像质量：丑陋，坏和好。具有非常低（A，B）和低信噪比（C，D）的图像数据集。外部和内部空间（B），中断和模糊边界信号（D）之间的差异较弱。具有高信噪比（G）和透明单元边界（H）的图像数据集。比例尺=10μm
  Video 1. Short tutorial for membrane-based 3D image segmentation using Imaris Cell. Selected points of the protocol are presented as follows: D. 3D-reconstruction and image processing: 2. Inspect the image quality, 3. Down-sampling, 5. in silico
3. 下采样（可选）（视频1）：编辑/重新采样3D /更改X，Y，Z中的值，并勾选"固定比X/Y/Z"选项。注意：细分速度取决于计算机环境。例如，在Imaris 8.3.1中，4分钟内分割了一个8位，灰度级，0.1 GB的图像（512 x 512 x 385像素），在带有3.20 GHz处理器的Intel Xeon E5 v3的PC上运行，Nvidia Geforce GTX Titan X显卡和SSD 850 PRO 1TB。在我们的情况下，在每个维度下采样2次，将时间缩短到2分钟，而不会造成质量损失，但这应由用户验证。
4. 将数据集裁剪到信息区域（可选）："编辑/裁剪3D"，移动滑块以创建捕获感兴趣区域的3D框（图3）。
  注意：如果信息区域表示图像的明确定义的子集，则建议执行此操作。如果对象具有复杂的形状，则推荐使用电脑扫描（参见步骤D5）。
  
  图3. 3D中的图像预处理 - 裁剪。感兴趣的区域占据比原始图像小的体积。图像在胚珠原基下围绕三维裁剪。 A.原始图像，3D体积渲染，"混合"模式; B.在"编辑"选项卡中，选择"裁剪3D"; C.调整弹出窗口中的三个滑块; D.裁剪（应用）：裁剪堆栈较小，分段速度更快。比例尺=10μm
5. 以解剖（可选）（视频1）：
  选择感兴趣的对象注意：
  1. 此步骤相对较快（几分钟），并且强烈建议用于高复杂度的图像，即捕获多个和/或混合对象以及对于其中仅一个子集为下游分析提供信息的图像。通常，该步骤特别有助于从邻近的周围和周围的心皮组织分离单个的胚珠。它还允许解决由于触摸组织造成不准确的细胞轮廓的问题。
  2. 如果使用此过程隔离了几个对象，请将其命名为便于下游步骤（单击"编辑/显示调整"选项卡中的通道名称）。
  1. 使用"添加新曲面"功能创建曲面并手动编辑。
  2. 在向导中，选择"跳过自动创建，手动编辑"。在"轮廓/自动调整"选项卡中，调整滑块的平滑形状和弱影响（最左侧的位置）。
  3. 绘制轮廓：在"轮廓/模式"下，选择绘图模式（未显示），在"轮廓/板"选项卡下，选择正交平面，激活"绘制"或Ctrl +空格键。
  4. 只有很少的轮廓足以在感兴趣的区域周围产生一个近似的表面;注意准确地定义开始，结束和中间平面。
  5. 在向导中，进入"创建曲面"，创建曲面对象（黄色）（图4B）。
  6. 在"编辑"选项卡中，单击"全部掩码"，然后勾选"应用蒙版之前的复制通道"框和"将表面外的体素设置为0.000"。创建一个新的通道（掩码），包括由表面捕获的体素，该通道用于分割。
    
    图4.图像预处理对于感兴趣的对象的剖析 A.原始堆栈是体积渲染的。 B.创建的表面呈黄色。 C.创建一个新的通道（掩码），包括由表面捕获的体素，该通道用于分割。比例尺=10μm
6. 在空间中旋转样品以使主增长轴沿YZ尺寸对准（图5和视频1）。
  注意：此步骤是可选的。然而，有利的是使样本沿着正交轴线之一排列，以便在细胞识别和标记期间的稍后阶段更容易地与切片器和指针进行导航。
7. 否则，选择另一个对齐，其中感兴趣的组织层/细胞在正交平面之一中。
  
  图5.图像预处理 - 样品旋转。 A.感兴趣的对象倾斜到右侧。样品旋转使用"自由旋转"进行，因此物体沿着y z轴（B，C）直线对齐。 D.主动剪取平面显示中纵向部分。比例尺=10μm
图像分割和标记
1. 自动细分（视频1）
2. 手动清除，合并和拆分功能
  根据本文所述的协议，自动分割通常对图像数据集进行6-15％的不准确分割是鲁棒的。整个图像的分割和分割过程主要来自异质边界信号。尽管合并阈值调整，一些单元格仍将保持超出或低于分段。下面描述了一组允许快速策展的方法。
  1. 在切片器模式下最好实现分割的检查。使用正交或斜面。
    注意：如果图像已被旋转（参见步骤D6），分辨率最低的轴不再像原始图像那样沿着z轴。
  2. 使用"编辑"选项卡中的"删除"，"合并"或"拆分"功能来策略错误的区域，以分别对不相关，欠分割和过度分割进行纠正。例如，要纠正过分区域，请选择属于同一单元格的两个错误段，并使用"合并"功能。相反，要纠正欠分段区域，请选择使用"拆分"功能重新分割两个（或多个单元格）的段。这个行动经常解决这个问题。如果它生成过分片段;然而，这些可以像以前一样再次合并（图10）。如果此操作无法解决问题，请按照步骤3.
    
    图10.手动合并和拆分功能。比例尺= 10μm。
3. 手工修复 - 重新分割小区域（ROI）
  当拆分和合并函数无法更正分割时，此方法特别有用。这个想法是在本地重新分割一个困难的区域，例如，具有干扰或变化的信号强度的单元格边界。为此，创建一个新的单元对象。但是，新的（正确的）单元格可以直接导入到第一个Cell对象中（至少在Imaris 8.3中）。它们首先必须导出为Surface对象。该过程如下所述。建议用户检查最新的软件版本，因为未来的改进可能会提供直接的单元格导入选项。
  1. 删除细分割的单元格（在切片器模式中选择"编辑/删除"）。
  2. 创建一个新的单元格对象（'添加单元格'）。
  3. 选择"仅区隔感兴趣区域"，并定义要重新分段的区域周围的框。为了更好地定位ROI，请保留前一个Cell对象在后台可见（切片器模式）。
  4. 按照向导自动分割，但尝试不同的参数。降低膜细节或最小的细胞直径通常会解决问题
  5. 如果ROI也捕获了以前正确更正的单元格，请删除它们（请参阅步骤E2b）。或者，具体选择要导入到第一个分割对象中的新单元格进行更正。
  6. 导出所选的，正确的单元格：选项卡"编辑/导出单元格到曲面"。选中"选择"框。创建表面对象"单元格导出"。
  7. 将Surface对象导入要进行策划的第一个Cells对象：'编辑/导入表面到单元格'。按照向导。验证切片器显示中导入的结果 - 现在更正了严重分段的区域。
4. 细胞标记 - 创建组织或细胞类型特定类别（视频1）
  为了根据它们的身份或组织层中的位置来分析细胞的统计（大小，几何描述，位置，等等），可以给细胞一个标签，对应于类别由用户定义。例如，组织层（表皮，皮层，L1，L2，等等），细胞类型（保卫细胞，根毛，前体，等等）或位置相对到轴（径向，基底，等等）。

数据分析

定量数据：可视化和导出
细胞标签可以分类与每个细胞对象相关的定量数据。可以有选择地导出变量（每个变量一个txt文件）或批量（每个单元格的所有变量一个txt文件）。常见的细胞变量包括面积，体积，球形度，椭圆率（扁平和长圆形），x，y，z坐标（质心）。完整列表包括大约100个变量（Imaris 8.3参考手册）。可以使用第三源数据分析软件（例如，R， www.r-project.org ）或在Imaris中的Vantage，如下所述。
1. 使用Vantage Plot进行可视化
2. 导出单元格段的各种描述符
  1. 在"文件/首选项/统计"中，选择要导出的统计值。否则，将包括所有统计资料。
    注意：ImarisCell中的"统计"一词是指与每个细胞对象相关的不同的定量描述（例如面积，体积，球形度，荧光强度等）。然而，它与数据的统计处理无关。
  2. 在单元格对象的"统计"选项卡中，选择"详细"类别。在下拉菜单中，选择所有值，平均值或特定值。
  3. 通过单击软盘图标"导出选项卡显示的统计信息到文件"导出所有值。浏览数据的存储位置。
  4. 默认情况下，文件名保存为.csv。但是，也可以另存为.xls和.xml。
  5. 导出的数据可用于绘制第三源数据分析软件中特定的单元格类别和定量测量（例如。，R， www.r-project.org ）。
    注意：每项研究在细胞和组织层比较方面都有自己的要求。数据绘制和统计分析可以使用生物科学推荐的标准软件和方法进行（ http://www.nature.com/collections/qghhqm ）。然而，一项建议是将该研究的基础用于相同样本阶段的至少十五个重复图像。这个数字考虑了处理样品制备过程中图像，数据和变异性所需的技术难度和时间。

笔记

该方案适用于各种组织。我们成功地对来自玉米，水稻，矮牵牛，小麦和马来西亚的组织进行成像和分割（数据未显示）。
染色质量的重现性取决于植物的健康状况和年龄。胁迫和/或老植物组织会染色不良，表现出较高的光散射（因此产生噪音）
分割的鲁棒性强烈地取决于整个3D图像中的信号的均匀性，如"分割"部分所述。
细胞对象的定量测量的变异性取决于样品制备的质量：如果组织在盖玻片下略微压扁，并且不显示原生3D形状，则图像不应用于分割。

食谱

改性假希夫碘化丙啶试剂
注意：在通风橱下准备以下解决方案。

固定
50％（v/v）甲醇 - 水
10％（v/v）乙酸 - 水
带有碘化丙啶（PI）的伪希夫试剂 100mM偏亚硫酸氢钠（Na 2 S 2 O 5 O 5）
0.15 M HCl
10μg/ml PI
水合氯解决方案
4克水合氯醛
1毫升甘油
2毫升蒸馏水
霍伊的解决方案
30克阿拉伯树胶
50ml蒸馏水
200克水合氯醛
20毫升甘油
通过搅拌过夜将阿拉伯树胶在30℃溶解在水中。加入水合氯醛;通过进一步搅拌溶解，最后加入20ml甘油。用玻璃棉过滤溶液。存放在室内，并保护在密闭的玻璃瓶中

致谢

这项工作由技术与创新委员会（CTI授权16997）和苏黎世百慕大基金会，苏黎世大学和瑞士国家科学基金会（SNF授予CB和UG）支持和资助。我们承认Peter Majer和Xuan Zhang（Bitplane R& D，苏黎世）与ImarisCell教授，Ueli Grossniklaus教授（UG）进行了深入的讨论和技术协助，为科学支持和有见地的讨论和技术支持部门组织支持和协助显微成像（Christoph Eichenberger，Valeria Gagliardini，ArturoBolaños，Peter Kopf）。染色方案基于先前发表的Truernit等人的工作进行。（2008）和吉田等人。（2014）。

参考

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