材料和试剂

（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：339652）
4厘米培养皿（AS ONE，目录号：1-8549-01）
感染菌株
Tris-乙酸盐 - 磷酸盐培养基
（任选的）叔丁基过氧化氢（t-BOHOH：终浓度，0.2mM）（WAKO Pure Chemical Industries，目录号：026-13451）
（可选）N，N' - 二甲基硫脲（DMTU：终浓度，75mM）（Sigma-Aldrich，目录号：D188700）
HEPES（pH 7.4）（NACALAI TESQUE，目录号：17514-15）
EGTA（DOJINDO，目录号：346-01312）
氯化钾（KCl）（NACALAI TESQUE，目录号：28514-75）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（NACALAI TESQUE，目录号：06731-05）
Phototaxis测定溶液（Okita等人，2005）（参见食谱）

设备

离心机（日立Koki，型号：CR20GIII）
旋转转子（日立Koki，型号：R4SS）
绿色发光二极管（LED）（λ= 525nm）（OptoSupply，型号：OSPG5111A-VW）
红光（或具有红色滤光片的白光[λ> 600nm]）
白纸/塑料
暗室或黑匣子
数码相机（SONY，型号：RX100II）
带相机安装的成像台（AS ONE，型号：NS-CPS360N）
带有摄像机的倒置显微镜（Olympus，型号：IX70; Wraymer，型号：1129HMN1/3）
红色滤光片（630 nm长通滤光片）（肖特，型号：RG630）
（可选）光度计（Apogee Instrument，型号：MQ-200）
（可选）中性密度滤光片（HOYA，型号：ND10AH和ND30AH）

软件

Image Hyper（Science Eye，Japan）或任何粒子跟踪软件（例如，，具有MTrack2插件的ImageJ）
Microsoft Excel或任何电子表格软件

程序

培养细胞在Tris-乙酸盐 - 磷酸盐培养基（Gorman和Levine，1965）中，在22℃，12小时/12小时光照/暗循环（光：〜30μmol光子， sec ^-1白光）至对数中期（〜3×10 6个细胞/ml）。
注意：必要时更改中等和其他文化条件。
通过在室温下以600×g离心5分钟收获细胞。
将细胞以〜1×10 7个细胞/ml（用于培养皿测定）或〜1×10 6个细胞/ml悬浮在光趋向性测定缓冲液中，用于在50 ml管
将细胞置于红光下（约40μmol光子m ^{-2 ^{sec ^-1）30-60分钟。
注意：这一步使细胞积极游泳（Sineshchekov et al。，2000）。另外，红光（λ）不刺激光诱导的主要感光蛋白1（ChR1），从而使细胞对后续的绿光照明敏感（Berthold等，2008）。 />}}
（用于餐具测定）将2ml细胞悬浮液放入陪替氏培养皿中，将其置于白片上并照射前拍照（图1A）。
注意：当需要正或负光趋向性的控制数据时，分别将最终的0.2mM t-BOOH或75mM DMTU加入到细胞悬浮液中。这些试剂可以添加到试管中的收获的细胞悬液中，或直接加入盘中的细胞悬液。 t-BOOH是一种对H 2 O 2 O 2具有相似作用的活性氧（ROS），可以用25μMH 2 O取代， /子> 0 <子> 2 。 DMTU是H 2 O 2 O 2清除剂，可以用50mM的4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基（TEMPOL）（TEMPOL） Wakabayashi等人，2011）。导出阴性光趋势控制的另一个选择是使用菌株CC-124（agg1）。它被认为是"野生型"，但其在agg1基因座中的突变导致强负的光合速率（Ide et al。，2016）。

图1.碟形光谱测定。 A.将4cm培养皿放置在白色塑料片上。一个绿色的LED被放在盘的侧面并固定。 B.在照明期间和C.照射5分钟。观察到正光趋势。 D.对于碟形测定，培养皿和LED被一个盒子覆盖以阻挡房间的光线。盒子的内部被黑色的布料遮掩，用于防反射。 E.在盘测定期间。在5分钟（或更长时间）照明之前和之后，照相机从顶部拍摄照片。
用绿色LED从一侧照亮菜，并用一个盒子盖住菜肴和LED（图1B，1D和1E）。离开他们5分钟（或更长时间）。用光度计检查光强度。通常，野生型细胞在低强度（<1μmol光子> sec ^{-1）处显示正光趋势，在较高强度（>5μmol光子m ^-2 sec ^-1）。要改变光强度，可以改变从LED到盘的距离和/或设置LED前面的ND滤镜。
注意：光吸收峰在495〜505nm（蓝 - 绿光）的作用光谱（Foster等，1984）。我们使用绿光，因为蓝光激活光合作用，这改变了细胞氧化还原状态以及光照标志（Takahashi和Watanabe，1993; Wakabayashi等，2011）。}
拍照（图1C）。
注意：请注意，这种"盘测定"不是光趋化测定的准确方法，因为光照会引起的细胞积累（称为光累积）也可能由于光休克反应而发生，因为细胞停止或停止感觉到光线强度的突然变化，会在短时间内向后游泳。该方法的目的是快速测试光触媒能力。光照运动被定义为沿着光束的运动，应该通过以下单细胞分析来检查。
（对于单细胞分析）将培养皿放置在倒置显微镜的平台上，并从侧面用绿色LED照明（图2）。观察光源附近区域的细胞（以必要时估计光强度）（λ> 600nm，〜5μmol光子，m ^{sec ^-1））和使用CCD相机的视频记录。

图2.细胞级光趋势分析的设置。将4厘米培养皿放置在倒置显微镜的一个阶段。箭头表示红色滤光片（630 nm长通滤光片）。箭头表示绿色LED。}

数据分析

使用粒子跟踪软件跟踪游泳池。 Image Hyper软件可以半自动的方式使用。对于使用Image J软件跟踪单元格，请将视频保存在未压缩的音频视频交错（AVI）格式中。使用ImageJ播放AVI文件。对图像进行二值化（单元格以黑色和背景显示为白色）。运行MTrack2插件。
将逗号分隔值（CSV）或电子表格软件的任何格式导出轨迹的数据（即，每个帧的单元格位置）。
在用绿色LED照射15秒后的1.5秒内，从轨迹测量光线方向和游泳方向之间的角度（θ）（图3A）。角度可以通过电子表格软件来计算。（如果使用Microsoft Excel，则可以计算如下：'= degrees（atan2（（x ₂ - x ₁），（y _{2 <其中（x 1，...，y 1）表示单元的主要位置的列，并且（x 2，y 2）代表1.5秒后的位置）。
注意：照射后几秒钟，可能会发生拍摄反应，并在该时间段后记录光照行为。

图3.细胞级光趋势分析。 A.用绿色LED照射15秒后测量每个细胞的游泳方向1.5秒，以避免拍摄反应的影响。 B.细胞水平分析（野生型细胞，随机游泳）的一个例子。使用Image Hyper软件自动跟踪游泳细胞的精心集中的图像。圆圈表示细胞的起点，线条表示其游泳轨迹1.5秒。（见视频1）。 C和D.极坐标直方图描述了相对于从右侧（0°）照射的光（特定方向为12°，30°; n =每个条件50个细胞）在特定方向移动细胞的百分比。 C.不亮时随机游泳的代表性数据; D.正面趋光性的代表性数据。〜80％的细胞游泳到0°。（Wakabayashi等人，2011）。

Video 1. Tracking cells using Image Hyper software. Cells showing phototactic swimming were auto-tracked under a dark-field microscope. Four cells were tracked in this movie, and the former three cells show positive, and the last cell show negative phototaxis. (This software is a Japanese product and some letters in the screen are written in Japanese.)}
为了绘制极坐标直方图，通常设定为12°的30°并绘制直方图（图3C和3D）。（如果需要，可以设置更多的箱子[例如24个箱子的15°]。）如果使用Microsoft Excel，使用"雷达"绘制图形（图4）。

图4.绘制极坐标直方图。显示Microsoft Excel的屏幕截图。通过相对于光照度轴的游泳角度计算第一直方图（列A和B）。然后将单元数合并到不同的角度类别（列C和D），如下：D2 = B11，D4 = B10，D6 = B9，D8 = B8，D10 = B7，D12 = B6，D14 = B5，D16 = B4，D18 = B3，D20 = B2 + B14，D22 = B13，D24 = B12。在每个类别（例如，类别90和60之间的每个类别（例如，75）之间插入空箱，以便将值绘制为条，而不是作为雷达图中多边形的点。在这个例子中，大多数细胞显示出负光照（光从0°照亮）
为了估计光照指数，计算每个细胞的cosθ。当检查光照，平均值cosθ。当细胞不被照射并沿随机方向游泳时，光照指数应为〜0。当100％的细胞显示明显的正或负光趋势时，光敏指数分别为1或-1。当检查光触媒能力（即平行于光束游动）时，可以忽略光触觉标志，平均|cosθ|的值。当100％的细胞与光束平行游动时，该指数为1.当细胞沿随机方向游泳时，指数为〜2 /π（Okita等人，2005）。

食谱

Phototaxis测定溶液（Okita等人，2005）
5mM HEPES（pH 7.4）
0.2 mM EGTA
1 mM KCl
0.3mM CaCl 2

致谢

这项工作得到了JSS KAKENHI Grant号15H01206,15H01314和KKK的16K14752的支持。该协议在2011年的Wakabayashi等人，2011和Ueki等人，2016中使用。

参考

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