材料和试剂

1 ml注射器和26 G针（Terumo Europe，Leuven，Belgium）
小鼠（从Janvier Labs，Le Genest-Saint-Isle，France购买的C57BL6/N小鼠）
香蕉气味（乙酸异戊酯）（Sigma-Aldrich，目录号：W205508）
杏仁味（苯甲醛）（Sigma-Aldrich，目录号：418099）
麦芽糖糊精（Sigma-Aldrich，目录号：419672）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
氯化锂（LiCl）（Sigma-Aldrich，目录号：203637）
香蕉溶液（0.05％）（见配方）
杏仁溶液（0.01％）（见配方）
麦芽糊精溶液（5％）（参见食谱）
蔗糖溶液（5％）（参见食谱）
合并的气味味道溶液（见食谱）
LiCl（3 M）（见配方）

注意：如先前所示，任何精神病药（例如苯丙胺或大麻素）可用作测试的阳性对照（Busquets-Garcia等，2017）。

设备

50 ml饮水管（Conical Centrifuge Tube，Thermo Fisher Scientific，Rochester，USA）
标准平衡
标准个别有机玻璃笼为每只老鼠
金属管（TD-100,2.5"直球点管，不锈钢，Ancare，纽约，美国）
25 mm直径孔的橡胶塞（Thermo Fisher Scientific，Rochester，USA）

注意：在开始实验之前，必须组装瓶子（图1）。

图1.协议中使用的饮用瓶。如图所示，将瓶子小心地放在一起。请注意，金属管必须穿过橡胶塞，并且必须避免所有可能的泄漏。

程序

将小鼠放在具有控制温度（21±1℃）和湿度（55±10％）的房间中的单个笼中。
小鼠在方案第一天之前24小时被水剥夺。这种水分剥夺持续了协议的全部时间，小鼠的体重也受到控制（保持在原始的85-90％左右）。
所有动物接受水1小时（使用饮用水，图1）。在此期间之前和之后，将瓶子称重，以精确量化每次饮食中多少动物。这个程序在连续三天作为习惯期重复。
注意：

如果一只小鼠在一小时内不能喝1毫升以上的饮料，则可以使用瓶子一个多小时。这在动物尚未习惯的第一天尤其重要。
每天更换瓶子的位置（右或左，见图2）。在整个协议中保持瓶子的高度和角度。

图2.瓶子的位置。瓶子的位置在方案中改变（参见程序），以便习惯从两个位置喝小鼠。然而，瓶子必须在整个协议中保持在相同的高度和角度。请注意，食物分布在金属网格的两侧。

在接下来的日子里，进行气味 - 配对阶段（预处理，图3），其中动物暴露于6种气味味配对。每个配对由两天组成：第一天，动物接受含有新味道（5％蔗糖或5％麦芽糖糊精;味道1，T1）和新颖加味剂（0.05）的口味水溶液1小时％香蕉或0.01％杏仁;气味1，O1），以便将T1与O1配对。在第二天，动物可以获得新的味道和气味，这些都不是前一天提出的，例如，味道2（T2）和气味2（O2）。 > 注意：
1. 必须首先使用3种气味 - 配对（而不是6种）来测试任何新的小鼠品系或遗传小鼠模型，以便确定所讨论的小鼠品系是否易于呈现介导的厌恶（Busquets-Garcia等人， 2017年）。在我们最近的工作中，对照小鼠（例如，C57BL6/N）在3次配对后呈现明显的介导的厌恶。然而，当预处理期间的训练次数增加（6或9对）时，动物不再存在介导厌恶。因此，我们使用6配对方案来研究精神病药物的急性影响（Busquets-Garcia et al。，2017）。然而，当使用新的线（例如，CB1敲除小鼠）时，必须首先确定动物能够在有限的训练之前显示介导的厌恶，然后才能在长训练方案中进行测试。某些小鼠模型很可能会导致中介厌恶的发展受损。事实上，气味介导的味觉学习长期以来一直用作学习测试，其中不同的基因型或小鼠模型在介导厌恶中呈现特征性表现。
3. 最近已经证明了对特定气味或口味的偏好（Busquets-Garcia et al。，2017）。
4. 气味味道溶液每2-3天重新制备，所有瓶子在预处理阶段结束时彻底清洁，以避免残留味道持续到下一个阶段。
图3.行为范例的简单表示用于评估气味介导的味觉厌恶（上）和味道介导的气味厌恶（底部）的方案的模式。对于更详细的模式，请参阅布加斯加 - 加西亚等人，2017年。在预处理之前，所有动物在连续三天内获得1小时的水供水习惯。接下来，进行气味味配对阶段，其由6种气味配对（Busquets-Garcia等人，2017）组成。每次配对持续两天：第一天，动物接受1小时的通路，可以获得含有新味道（T1）和新颖的气味剂（O1）的风味溶液，以便将T1与O1配对。在第二天，动物收到前一天没有出现的味道和气味，即，T2和O2。在接下来的日子里，动物进入O1（上）或T1（底部）贬值的调理（或贬值）阶段。在这个阶段的第1,3和5天，动物接受1小时的通气，接近O2（上）或T2（底部），然后腹膜内（ip）注射盐水，而在第2,4和6天，他们接受1-h访问O1（上）或T1（底部）紧随其后的ip注射内脏不适诱导药物氯化锂（LiCl，0.3M，1％b.w.）。在这种调理之后，给动物一天进行恢复，在1小时内他们接受水。在接下来的2天中，使用1小时双向选择测试（顶部和底部）评估介导和直接反应。在试验1中通过介导的CS +（mCS +：分别由以前与LiCl-配对的CS气味或味道相关联的味道[顶部]或气味[底部]刺激组成）之间的选择来评估介导的厌恶）和介导的CS-（mCS-：分别由先前与盐水对应的CS气味或味道相关联的味道[顶部]或气味[底部]刺激组成）。如果在同一天，研究人员有兴趣了解给定药物对介导的厌恶测试（Busquets-Garcia等人，2017年）的影响，则可以在测试之前进行急性治疗。然后，在第二天，通过调节的LiCl配对刺激（CS +）和条件生理盐水配对刺激（CS-）之间的选择来评估直接厌恶。
在接下来的6天内，动物经历贬值阶段（图3），由此O1贬值成为条件刺激（CS +）。在该阶段的第1,3和5天，动物接受1小时的通气，然后腹膜内（ip）注射盐水（CS-），而在第2,4和6天，他们接受1小时的通路O1紧随其后注射催吐剂LiCl（0.3M，1％b.w.，即10ml/kg）（CS +）以诱导胃部不适。
注意：

为了评估味觉介导的气味厌恶，使用口味进行贬值阶段配对。 T2与盐水注射（CS-）相关，而T1与LiCl注射（CS +）相关。
每个配对都会更改瓶子的位置（右侧或左侧见图2）。在整个协议中保持瓶的高度和角度。
在取出瓶子之后执行LiCl注射。注射后几分钟，动物观察到头晕，大大减轻了运动。
气味或味道溶液每2-3天重新制备一次，所有瓶子在本阶段结束时彻底清洗。

动物被给予一天的恢复，在那里他们接受水1小时。
注意：水瓶的位置与最后配对的位置相反。
在第二天，使用1小时双选择测试来评估介导厌恶，其中两个不同的瓶子同时呈现（图4）。介入厌恶总是在测试的第一天进行评估，并选择mCS +和mCS-。每个瓶子的放置是平衡的，以避免任务性能中的任何位置偏差。根据我们的经验，在预处理过程中控制中等训练的动物（3对）发展中介厌恶。值得注意的是，如果培训课程增加（6对或9对），动物不会出现中介厌恶（参见Busquets-Garcia et al。，2017，以获取更多信息）。
注意：
1. 为了评估味觉介导的气味厌恶，这种双选择测试使用两种不同的气味瓶进行。
2. 在本次测试开始时，使用"强制取样"程序来确保小鼠对两种流体进行采样。两个瓶子都呈现：当鼠标舔了一个瓶子之后，这个瓶子被取出，直到舔第二个瓶子。当发生这种情况时，第二瓶也被移除。最后，两瓶同时呈现。在强制抽样过程中瓶子的展示顺序是平衡的，以避免任何订单偏差。
图4.双选项测试在双选项测试期间，两个瓶子（，品味或气味）在一小时内可用。为了使动物意识到选择，请按照以下步骤执行"强制取样"程序：（i）两个瓶子同时呈现，（ii）当从一瓶瓶中取出动物饮料时， iii）允许老鼠从剩余的瓶子中饮用时间，（iv）移除第二瓶，最后，（v）两个瓶子同时重新引入，如图所示，选择测试执行。
在第二天，使用CS +和CS-之间的两选择测试来评估直接厌恶，其过程与介绍的厌恶测试所述相同。

数据分析

厌恶是通过mCS +的消耗低于mCS-（介导的厌恶）或CS +比CS-（直接厌恶）（Soria-Gomez等人，2015年; Busquets-Garcia等）。，2017）。将数据作为绝对液体摄入量，使用以下公式计算厌恶指数：用于直接厌恶或（mCS- - mCS +）/（mCS + + mCS-）的介导的（CS- - CS +）/（CS + + CS-）厌恶。

笔记

所有动物在实验前至少保存5天
实验方案的所有会议在早晨（上午9点至下午1点）进行。
为了避免瓶子之间发生任何嗅觉污染，使用了3种不同的瓶子：一些瓶子专门用于香蕉气味或香味香气混合物，即蔗糖或麦芽糖糊精（香蕉瓶），其他仅适用于杏仁气味或混合杏仁味与味道（杏仁瓶）和剩余的瓶子单独使用水或味道（水/味道瓶）。床上用品在协议开始时和预处理阶段之后，在上一届会议后几个小时更改
该任务在几条小鼠线上进行了测试。我们在C57/BL6N小鼠和我们研究所生产的野生型动物之间发现了类似的结果

食谱

香蕉溶液（0.05％）
向每100ml水中加入50μl乙酸异戊酯。为了准备这个解决方案，我们把必要数量的水放在一个容器中，我们添加了以前计算出的气味量。然后将溶液混合直至气味溶解
杏仁溶液（0.01％）
向每100ml水中加入10μl苯甲醛。为了准备这个解决方案，我们把必要数量的水放在一个容器中，我们添加了以前计算出的气味量。然后将溶液混合直至气味溶解
麦芽糊精溶液（5％）
向每100ml水中加入5g麦芽糖糊精。为了准备这个解决方案，我们把必要数量的水放在一个容器中，我们添加了以前计算出的味道数量。然后将溶液混合直至粉末溶解为
蔗糖溶液（5％）
向每100ml水中加入5g蔗糖。为了准备这个解决方案，我们把必要数量的水放在一个容器中，我们添加了以前计算出的味道数量。然后将溶液混合直至粉末溶解为
组合气味味溶液
按照与上述相同的数量，我们称量所需量的蔗糖或麦芽糖糊精，我们添加了必要量的水，最后是气味。然后将溶液充分混合，直到完全溶解，透明度达到
LiCl（3 M）
称量0.627g LiCl粉末并加入到50ml生理盐水中。然后将溶液充分混合直至粉末溶解为

致谢

我们感谢Delphine Gonzales，Nathalie Aubailly以及NeuroCentre Magendie动物设施的所有人员进行鼠标护理。我们还要感谢所有执行实验工作的人：Yarmo Mackenbach，Bastien Redon，Carolina Muguruza，Geoffrey Terral，Camile Pernegre，Christina Ioannidou和Marjorie Varilh。我们还感谢Christopher Stevens对稿件的批判性阅读。该方案根据McDannald MA等人进行了修改。（2011年）。这项工作得到了INSERM（对GM），INRA（GF），EU-FP7（PAINCAGE，HEALTH-603191至GM和FP7-PEOPLE-2013-IEF-623638至AB-G）的支持，欧洲研究委员会（Endofood， ERC-2010-StG-260515; CannaPreg，ERC-2014-PoC-640923，转基因），基金会基金会（DRM20101220445和DPP20151033974，GM），人类前沿科学计划（GM），阿基坦地区），法国国家/国民大会（GLAIN ANR-10-LABX-0043至GM，ANR-10-IDEX-03- 02至AB-G，NeuroNutriSens ANR-13-BSV4-0006-02至GM和ORUPS ANR-16-CE37-0010给GM和GF），Fyssen基金会（ES-G。）和CONACyT（到ES-G。）。

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