材料和试剂

洗涤和高压灭菌的玻璃纸（FUTAMURA CHEMICAL，目录号：PS-1）
9厘米塑料培养皿（SANSEI MEDICAL，目录号：01-013）
1.5ml塑料管（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：131-415C）
15 ml塑料管（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：1332-015S）
PCR管（NIPPON Genetics，FastGene，catalog number：FG-028DC）
10μl塑料移液器吸头（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：123R-254CS）
200μl塑料移液器吸头（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：123R-755CS）
1,000μl塑料移液器吸头（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：122-804B）
小立碗藓的质子（或其他苔藓）
pSCgRNA，pSCOE1-fcoCas9（野村等，2016，图1A）
DH5α感受态细胞（自制）
NEBuffer 2.1（New England Biolabs，目录号：R0539S）
I（New England Biolabs，目录号：R0539S）
无菌MilIi-Q水
GEL/PCR纯化小套件（Favorgen Biotech，目录号：FAGCK 001-1）
连接高ver.2（TOYOBO，目录号：LGK-201）
ScU6p插件检查F引物5'-GAGGATCACGGTGTCACATGTCC-3'
Quick Taq ^® HS DyeMix（TOYOBO，目录号：DTM-101）
ScU6p Seq检查F引物5'-ATGTCAAACATAACCTGG-3'
氨苄青霉素（NACALAI TESQUE，目录号：02739-74）
质粒DNA提取微型试剂盒（Favorgen Biotech，目录号：FAPDE 001-1）
琼脂糖S（NIPPON GENE，目录号：312-01193）
DNA梯子标记（SMOBIO Technology，目录号：DM3100）
NucleoBond ^® Xtra Midi（MACHEREY-NAGEL，目录号：740410.50）
G418硫酸氢盐（NACALAI TESQUE，目录号：16512-81）
BCDAT培养基（Nishiyama等人，2000）
葡萄糖（和光纯药，目录号：049-31165）
Tks Gflex DNA聚合酶（Takara Bio，目录号：R060A）
Zero Blunt PCR Cloning Kit（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：K275020）
CloneJET PCR克隆试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：K1231）}
LB琼脂，Miller（BD，Difco ^TM，目录号：244520）
LB肉汤，Miller（BD，Difco ^TM，目录号：244620）
三羟甲基氨基甲烷（NACALAI TESQUE，目录号：35434-21）
氯化钾（Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03545）
乙二胺四乙酸（EDTA）（DOJINDO，目录号：345-01865）
乙酸（和光纯药，目录号：017-00256）
溴化乙锭溶液（NACALAI TESQUE，目录号：14631-94）
含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板（参见食谱）
裂解缓冲液（见配方）
50 x TAE缓冲液（见配方）
1x TAE缓冲区（见配方）

设备

植物生长室（SANYO，型号：MLR-350HT）
微量移液器（Eppendorf，型号：Reference ^® 2）
无菌镊子（电子显微镜科学，DUMONT，目录号：0108-5-PO）
热循环仪（PCR Thermal Cycler Dice Gradient，Takara Bio，型号：TP600）
高速离心机（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：MX-300）
块孵化器（ASTEC，型号：B1-515A）
分光光度计（GE Healthcare，型号：NanoVue）
高压灭菌器（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：SX300）
琼脂糖凝胶电泳设备（Cosmo Bio，型号：i-MyRun.N）
紫外透射仪（ATTO，型号：DTB-20MP，TYPE-CX）
加热培养箱（SANYO，型号：MIR-262）

程序

sgRNA表达载体的设计与构建
1. 选择目标序列
  1. 选择目标基因或基因组区域中的20 bp靶序列（图1B）。
    1. 检查目标序列3'末端的原始相邻基序（PAM）序列（5'-NGG-3'）。
    2. 为了诱导基因功能异常突变，靶序列应设计在5'末端或功能域附近。
    3. 避免poly-T序列作为sgRNA的转录终止子;确保G + C含量为40-80％
    4. 如果靶位点包含限制酶的识别位点，则可以对基因分型进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析。
      注意：已经报道截短的sgRNA可以减少脱靶效应（Fu等，2014）。我们确认截断的sgRNA（18或17bp靶序列）在我们的系统中起作用;不过，我们尚未评估其目标效率
  2. 添加以下用于克隆的衔接子序列（图1B）：正义寡核苷酸的5'-TCTG-3'和反义寡核苷酸的5'-AAAC-3'。
2. 消化pSCgRNA载体（图1C）
  1. 准备消化混合物，如下所示：
  2. 将混合物在37℃下孵育3小时。
  3. 使用DNA纯化试剂盒（Favorgen GEL/PCR Purification Mini Kit）纯化I消化的pSCgRNA载体 Bbs。
3. 寡核苷酸退火（图1C）
  1. 准备退火混合物，如下所示：
  2. 在热循环仪中在95℃孵育5分钟。
  3. 从热循环仪中取出管，并使混合物在工作台上在20-25℃冷却30分钟。
4. 将退火的寡核苷酸克隆到pSCgRNA载体中（图1C）
  1. 准备连接混合物，如下所示：
  2. 将混合物在16℃下孵育3小时以上。
  3. 使用2μl连接混合物转化DH5α感受态细胞，并在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上铺展。
  4. 将LB板在37℃下孵育14-16小时
  5. 使用ScU6p Ins混合PCR反应混合物。检查F引物（作为正向引物）和反义靶序列（作为反向引物）
  6. 通过执行以下循环的菌落PCR验证插入：
    
    注意：如果克隆成功，则将扩增和检测到一个950bp的条带（图1D）。我们建议至少测试8-16个殖民地。
  7. 在50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养阳性菌落。
  8. 使用质粒DNA迷你准备试剂盒（Favorgen Plasmid DNA Extraction Mini Kit）纯化质粒
  9. 使用ScU6p Seq确认pSCgRNA载体中插入的靶序列。使用Sanger测序检查F引物。
    
    图1.使用RNA引导的内切核酸酶在苔藓中进行靶向诱变的载体构建。 A. Cas9和sgRNA表达载体的示意图; B.目标序列设计实例构建sgRNA表达载体的方法D.用于检查插入靶序列的菌落PCR的代表性结果。 M：DNA梯子标记。
PEG介导的原生质体转化（图2A）
1. 纯化含有靶序列的pSCgRNA和pSCOE1-fcoCas9，其中骨架是pTN182载体（Sakakibara等人，2008），使用midi制备试剂盒（NucleoBond，Xtra Midi ），并以1μg/μl的无菌TE缓冲液稀释。使用15μg每种质粒进行转化
2. 使用PEG介导的原生质体转化方法共同转化两个载体，如先前的报告（Nishiyama等人，2000; PHIBCOmanual ver.2.0 in NIBB PHYSCObase website： http://moss.nibb.ac.jp/protocol.html ）。
  
  图2.使用RGENs获取突变株的方案概述
使用抗生素G418（遗传霉素）进行质子细胞的再生和瞬时筛选。
1. 将转化的原生质体接种在玻璃纸上的PRM/T和PRM/B板上，在植物生长室中将混合物在25℃下孵育7天（图2B）。
2. 对于瞬时筛选，将再生的质子转移到玻璃纸上的PRM/T中的原生质体到具有20μg/ml G418的新BCDAT平板（图2C）。
3. 在植物生长室培养板5 d（图2C和3）
  
  图3.瞬时筛选后的质子的实例（ppFtsZ2-1靶向）。 A.死质子的代表性例子B.生存的代表性例子。菌株也显示了PpFtsZ2-1突变的表型。刻度棒=50μm。
4. 将PRM/T玻璃纸中存活的质子转移到新的BCDAT平板上，再次培养直到形成小菌落（图2D）。
5. 使用镊子，选择殖民地边缘的质子，并将其转移到新的BCDAT或BCDAT + 0.5％葡萄糖板（图2D）。
6. 对于基因分型，培养质子直到菌落直径为5-10mm。
  注意：获得的菌株有可能是马赛克植物，其是具有不同突变或野生型的菌株的混合物。如果是这样，我们可以从原生质体，单个质子分枝或游戏头条的叶子中分离单基因株。
基因分型
1. 绿色PCR
  1. 将一些新鲜的质子转移到PCR管（图4A），并使用200μl移液管芯片的尖端研磨成50μl裂解缓冲液（参见食谱）（图4B）。
    
    图4.绿色PCR的模板的制备 A.裂解缓冲液中新鲜的质子的一小部分; B.在裂解缓冲液中用200μl芯片的尖端压碎的质子
  2. 在95°C孵育10分钟。
  3. 将3,500 x g的碎屑旋转10秒，并使用上清液作为PCR模板。
  4. 使用免费在线工具Primer 3设计引物套件（ http://primer3.ut.ee/），用于扩增基因组DNA，包括用于测序或其他基因分型的靶位点，如RFLP。
    、
  5. PreparePCR反应混合物，如下所示：
  6. 扩增PCR产物，包括基因组的靶位点，其周期如下：
2. 限制片段长度多态性（RFLP）分析
  1. 如果靶位点包含限制酶的识别位点，则可以通过RFLP观察到靶向的诱变。
  2. 通过琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物后，使用相应的限制酶消化PCR产物
  3. 经过充分消化后，通过琼脂糖凝胶电泳分析酶处理和未处理的PCR产物。限制酶耐受性PCR产物可能有突变。
    注意：如果使用衍生自野生型和突变型菌株的PCR产物的混合物，则可以使用可以识别和切割非完全匹配的DNA的T7内切核酸酶I或cel1测定来检查靶向诱变。作为高通量和全面的基因分型方法，也可应用高分辨率熔解分析或下一代测序
3. 基因组靶序列的测序
  1. 通过琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物后，使用Zero Blunt PCR Cloning Kit或CloneJET PCR Cloning Kit将PCR产物克隆到测序载体中。
  2. 在菌落PCR和微型制备后，通过Sanger测序检查几个克隆的插入PCR产物的DNA序列注意：如果PCR产物作为单基因植物中的单一条带存在，则可以通过直接测序来检查。

数据分析

根据我们基于目标基因突变引起的表型变化的评估，目标诱变效率在P < patens 约为45％至68％（Nomura等人，2016）。由于效率取决于目标序列，因此建议您使用"focas"网站（ http：//focas.ayanel.com/; Doench等人，2014; Xiao等人，2014; Osakabe等人，2016），用于设计和预测目标基因组的目标和离靶目标效率。在这种情况下，目标评分为0.6以上的靶序列和脱靶效果的可能性较低是理想的。

笔记

通过使用设计用于基因组上的远端位点的两种gRNA，可以通过该方法引入长缺失突变（〜3kb）（野村等，2016）。
在该方法中，载体DNA通常不被整合到苔藓基因组（Nomura等人，2016）中。
在PEG介导的原生质体转化过程中存在形成多倍体的可能性。获得性菌株中的DNA含量应使用流式细胞仪进行评估
如果该协议适用于其他物种，可能需要修改一些实验条件，例如转化（例如，PEG治疗时间）和筛选方法（例如）。，抗生素浓度和选择持续时间）

食谱

LB琼脂平板与50μg/ml氨苄青霉素 LB琼脂，米勒40克
用MilIi-Q水和高压釜（121℃，15分钟）填充1升加氨苄青霉素至终浓度为50μg/ml
裂解缓冲液
100mM Tris-HCl（pH9.5）
1 M KCl
10 mM EDTA
50 x TAE缓冲区
2 M Tris
1 M乙酸
0.5 M EDTA（pH = 8.0）
1 x TAE缓冲区
20 ml 50 x TAE缓冲液
980 ml MilIi-Q水

致谢

该协议是从已发表的论文（Nomura等人，2016）改编而来的。这项工作得到了日本科学促进会，青年科学家赠款（B）（授权号15K18824）和科学研究助学金（C）（授权号15K06905）的支持。

参考

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