材料和试剂

来自E的脂多糖（LPS）大肠杆菌（Sigma-Aldrich，目录号：L2630）
汇合的J77A鼠巨噬细胞（可得自Sigma-Aldrich，目录号：91051511）的烧瓶（或培养皿）
10x胰蛋白酶-EDTA溶液（Life Technologies，Gibco ，目录号：R-001-100）
1×10 7/ml/ml真菌分生孢子（悬浮于0.001％Tween 20中）（从10天25℃琼脂平板收获）
1mg/ml荧光增白剂28（calcofluor）（Sigma-Aldrich，目录号：F3543）
70％乙醇（任何供应商）
NaCl（ChemSupply，目录号：SA046）
KCl（ChemSupply，目录号：PA054）
MgSO 4（ChemSupply，目录号：MA048）
NaOH（ChemSupply，目录号：SA178）
（Thermo Fisher Scientific/Ajax Finechem Pty，目录号：A621）。
（Merck KGaA，产品编号：1048729025）< br />
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：26140）
青霉素链霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P0781）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：59202C）
Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D6546）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
PIPES（Sigma-Aldrich，目录号：P6757）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E4378）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
4％固定溶液（见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
完成DMEM（参见配方）
0.001％Tween 20（参见配方）
PME缓冲区（参见配方）

设备

标准台式离心机
Clyde-Apac BH2000系列生物安全柜II类
带有UV过滤器（Reichert-Jung）的Leica显微镜
带有摆动转子的制冷离心机（Beckman Coulter，型号：TJ-6）
细胞培养孵育器（37℃，5％CO 2）
本生灶
孔无菌细胞培养板（Greiner Bio-One，目录号：657160）
一次性无菌10ml移液管（Corning Incorporated/Costar stripettes，制造号：4488）
无菌10ml离心管（任何供应商）
22 x 22毫米标准显微镜盖玻片（任何供应商）
76 x 26 mm标准显微镜载玻片（任何供应商）
指甲油（任何供应商）
生物安全柜
血细胞计数器
镊子
25cm 2小瓶
75cm 2 大瓶

程序

注意：在生物安全柜中执行的所有步骤。使用无菌材料和试剂和无菌技术。除非指明，否则所有孵育步骤均在37℃，5％CO 2下在细胞培养箱中进行。
第1天

在生物安全柜中，轻轻地从合并的J774鼠巨噬细胞的培养瓶（或培养皿）中取出培养基并丢弃。
用10 ml PBS轻轻洗涤细胞1次。
加入1×胰蛋白酶-EDTA溶液以分离细胞（对于25cm 2小烧瓶为1ml，对于75cm 2大瓶为2.5mL）。
在细胞培养箱中孵育30-60分钟以分离细胞
加入完全DMEM培养基以停止消化（小烧瓶为4ml，大烧瓶为7ml），并将细胞转移到无菌的10ml离心管中。
通过在1,500-1,800rpm离心8分钟来沉淀细胞
倒出培养基并丢弃并将细胞沉淀重悬在1ml完全DMEM培养基中。使用PBS中的稀释液和血细胞计数器计算细胞的浓度（总共加入1×10 5个细胞）。
拿着精细的镊子，将盖玻片浸入70％乙醇，通过将盖玻片的边缘放置在组织上，通过本生灯的火焰灭菌，通过多余的乙醇。将无菌盖玻片放入6孔无菌细胞培养板的孔中。重复，每孔放置盖玻片。
向6孔细胞培养板的每个孔中加入2ml完全DMEM培养基。每孔加入1×10 5个巨噬细胞。在细胞培养箱中孵育过夜（24小时）
第2天
向6孔细胞培养板的每个孔中加入0.1μg/ml LPS（总体积）。在细胞培养箱中孵育过夜（24小时）
第3天
用10毫升移液器从孔中删除介质，并丢弃。移取5ml PBS到每个孔中以洗涤细胞，然后移除并丢弃。重复3x。
向每个孔中加入2ml新鲜的完全DMEM培养基。向5个孔中的每一个加入1×10 6个真菌分生孢子（10μl的1×10 7个真菌分生孢子/ml悬浮液）（每个实验可以做5个不同的菌株），留下一个孔作为负感染对照。
在细胞培养箱中孵育2小时（以允许分生孢子的吞噬作用）
删除介质并丢弃。用5ml PBS轻轻洗去未结合的孢子。
要评估吞噬作用，请继续直到第4天。
为了评估酵母细胞生产，加入2ml新鲜的完全DMEM培养基，并在细胞培养箱中孵育24小时。

第4天
从孔中取出PBS或培养基并丢弃。加入2ml 4％固定液。在室温下离开30分钟。
取出固定液并丢弃。向每个孔中加入2ml PME以进行洗涤
在显微镜载玻片上，放置5微升0.001％吐温20.添加1微升0.1毫克/毫升calcofluor到吐温，并使用移液器吸头混合。
使用细镊子，从细胞培养板井盖和盖，倒置，巨噬细胞侧向下，到显微镜载玻片上。
污点与组织和密封与指甲消失。
在UV过滤器下的显微镜下观察。

食谱

PBS（1 L）
NaCl 8克
KCl 0.2克
Na 2 HPO 4 1.44 g
KH ₂ PO ₄ 0.24克
用蒸馏水补足至1 L。高压灭菌器无菌。
完成DMEM（100 ml）
10ml FBS（当这第一次到达时，它必须在56℃水浴中热灭活30分钟）。
青霉素链霉素溶液 1 ml
200 mM L-谷氨酰胺 8 ml
DMEM 85 ml
4％固定溶液（100ml） 4g多聚甲醛在100ml PME缓冲液中的溶液准备
时戴上口罩
PME缓冲液（1 L）
PIPES 15.12克
EGTA 9.51克
1M MgSO 4的储液 5 ml
使用NaOH将pH调至6.7（化学品将不溶解，直到几乎达到正确的pH）
0.001％吐温（1L）
将10μl悬浮于1L水中的吐温20

致谢

这项工作是由澳大利亚研究委员会，澳大利亚国家卫生和医学研究理事会和霍华德休斯医学研究所资助。

参考文献

Boyce，K. J.，Schreider，L.，Kirszenblat，L.和Andrianopoulos，A。（2011）。双组分组氨酸激酶 DrkA 和 SlnA em>是需要用于在人类病原体中的 in vivo 生长。 Mol Microbiol 82（5）：1164-1184。 />
Vanittanakom，N.，Cooper，C.R.，Jr.，Fisher，M.C.and Sirisanthana，T。（2006）。马尼埃青霉感染和流行病学和分子生物学方面的最新进展。 Clin Microbiol Rev 19（1）：95-110。