材料和试剂

双刃刀片（上海RAZOR刀片，目录号：74-s或Gillette，目录号：PLATINUM-PLUS ^®）
显微外科刀片（Salvin Dental Specialties，目录号：6900）
Superglue（氰基丙烯酸酯，ALTECO CHEMICAL的产品，目录号：SG-12）
吉非非诺（浙江AOKI医用敷料或辉瑞，目录号：AZL0009034201）
24孔细胞培养板（Corning，NY）
90mm培养皿（广州喷气生物过滤，目录号：TCD010090）
滤纸（高压灭菌器）
牙签（高压灭菌）
手术缝线（扬州金环医疗器械厂，材质：丝，尺寸：5-0 UPS标准）
1ml胰岛素注射器（山东威高集团医用聚合物，目录号：B-D328404Z或BD，目录号：328404）
5 ml塑料移液器（灭菌）
小鼠
注意：强烈推荐使用3-4岁月龄的小鼠作为本方案的宿主小鼠（受体），胎儿胚胎第14天（E14）或E15（两性）用作供体，小鼠的菌株取决于研究的目的。
75％乙醇（天津富宇精细化工）
红霉素软膏（也推荐使用石蜡基润滑剂）
碘酊
氯胺酮（Fujian Gutian Parma，目录号：H35020148）
赛拉嗪（Sigma-Aldrich，目录号：X1251-1G）
氯化钠（NaCl）（北辰芳正，天津;或Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
氯化钾（KCl）（天津海光;或Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（第六化工厂，天津;或Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S9763）
氯化钙（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：63138）
（Sigma-Aldrich，目录号：H7006）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5767）
注意：本产品已停产。
葡萄糖
聚氨酯（Sigma-Aldrich，目录号：94300）
氯胺酮 - 赛拉嗪混合物（KX）（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）（见食谱）
聚氨酯溶液（参见食谱）

设备

牙科钻（SEASHIN PRECISION，目录号：STRONG 90）
弯曲剪刀，切割刃：14毫米，材质：不锈钢（精细科学工具，目录号：14084-09）
加热垫（Tme，型号：JR-1/2 DC）
解剖显微镜（Olympus，型号：SZ61）
直剪刀，切边：14毫米，材质：不锈钢（精细科学工具，目录号：14085-09）
薄型镊子（精细科学工具，型号：Dumont＃5）
直镊子（VETUS，目录号：ST-14）
弯曲镊子（精细科学工具，型号：Dumont＃5/45）
定制钢板（见图1B）
压缩空气（Sunto，目录号：ST1005）
生物安全柜（江苏苏晶集团，型号：BCM-1300A）
冰箱

软件

ImageJ软件（ http://rsb.info.nih.gov/ij）

程序

宿主小鼠的制备（图1A阶段1;视频1）
注意：男性和女性都可以在本协议中作为收件人使用。从怀孕小鼠中提取的胚胎第14天（E14）或E15，胎儿胚胎组织（不论其性别如何）可以移植到〜3个宿主小鼠（成功移植意味着从一个胚胎皮层的皮层组织已被移植到受体的病变腔），因此可以制备〜3宿主小鼠。

图1.该方案的实验程序 A.显示移植手术程序的图，包括宿主小鼠（第1阶段）的制备，胚胎脑组织制备（阶段2）和移植胚胎皮层组织主持大脑（第3阶段）。在第1阶段，对宿主小鼠进行开放式颅骨窗口，并在宿主脑皮质中钻孔。在第2阶段，从胎儿小鼠中提取胚胎脑。在第3阶段，从胎儿脑切割一块胚胎脑组织，并将其移植到成年小鼠皮层的损伤腔中。 B.将主机鼠固定在定制钢板上。 C.移植手术后宿主大脑的剖面图。颅骨窗口被骨瓣覆盖，并使用Superglue胶合到头骨。

Video 1. Preparation of the host mice
1. 用氯胺酮 - 赛拉嗪混合物（KX，参见食谱）腹膜内注射（100μl/20g体重）深度麻醉小鼠。麻醉的小鼠被监测，直到踏板取出反应丧失
2. 使用75％乙醇灭菌所有外科手术工具，并用红霉素软膏（或石蜡基润滑剂）润滑鼠标的眼睛，以保护手术期间的眼睛免受干燥。
3. 用水润湿头发上的头发，用剃须刀刮头部头发。
4. 用碘酊消毒剃光头皮，并在头皮上形成弧形切口（图1A级1）。分开头皮并暴露头骨。用显微外科刀片去除颅骨上的所有筋膜。
5. 标记颅骨上的感兴趣区域（在这种情况下为2.5毫米宽，2.5毫米外侧），并将颅骨粘贴到定制的金属框架上（通过用Superglue将两个双层剃须刀刀片彼此面对地相连制成（（一个标准的立体定位框架也可以用于这种手术），确保头骨已经与金属框架紧密地胶合，然后将框架紧紧地固定在定制的钢板上（图1B）。
  注意：金属框架不应该粘在骷髅头上，直到头骨被完全干燥，否则金属框架将无法紧贴颅骨。
6. 使用高速牙钻使圆形颅面（直径约2 mm）的边缘变薄，并用压缩空气清洁颅骨碎片。慢慢地钻，并防止钻头刺穿稀疏的头骨。
  注意：通过频繁添加PBS（室温）防止变薄区域过热。
7. 颅骨已经变薄后，用弯曲的镊子轻轻取出骨瓣（分离的颅骨片）。用一块浸泡在PBS中的一块凝胶凝胶阻止暴露的硬脑膜出血。
8. 用PBS清洁骨瓣（参见食谱），然后将其放入装有新鲜PBS的24孔培养板中。
9. 选择皮质区域（避免大血管），并使用高速牙钻和新的消毒钻孔头创建创伤性病变腔（直径约1毫米，深度1毫米）。
10. 用PBS浸泡的海洛因清洗创伤性病变腔内的组织碎片和从损伤腔泄漏的血液。将金属框架从小鼠颅骨上取下，如有必要，可以使用海洛因从创伤性病变腔中进一步出血。
11. 用一块浸泡在PBS中的一片海藻盖住暴露的皮层，以阻止病变腔的出血。将鼠标放在加热垫上并监测麻醉状态（使动物处于手术麻醉水平，如果需要，可以注射更多的KX）。
  注意：经常将PBS逐滴加入到海洛因中，保护皮质免受干燥。
胚胎脑组织准备（图1A阶段2;视频2）
注意：为了保持胚胎皮质组织的活力，请尝试在20分钟内完成手术过程（提取和移植）。在胚胎第14天（E14）或E15从胎儿提取的皮层组织适用于胚胎皮层组织移植。

Video 2. Preparation of the embryonic brain tissue
1. 用75％乙醇灭菌所有手术工具，包括解剖显微镜，四个培养皿，直剪刀和两个薄镊子，并在生物安全柜内将其保持在紫外线照射下30分钟。
2. 准备四种培养皿，并将10ml 4℃HBSS（参见食谱）倒入每个培养皿中使用。
  注意：使用前请将HBSS放在4°C冰箱中。
3. 用致死剂量的氨基酸（参见食谱）（约400μl）对怀孕的小鼠进行安乐死，并用75％乙醇灭菌。执行腹部切口，然后取出整个子宫角，并将其转移到用冷HBSS制备的培养皿中。
4. 切开子宫角，取出各胚胎的羊膜。将胚胎转移到另一种培养皿中
5. 切断胎头，用4°C HBSS将头部转移到另一个培养皿中，然后在夹层显微镜下剥离头皮和头骨。用一对镊子轻轻取出脑膜，以充分暴露胚胎大脑。分离皮质组织，并保持在另一种具有冷HBSS的培养皿中。
将胚胎皮质组织移植到宿主大脑（图1A阶段3;视频3）

Video 3. Transplant the embryonic cortical tissue to host brain
1. 在主人小鼠的脑部脱掉海洛因，如有必要，使用海洛因清除病变腔内剩余的液体或血液。
  注意：暴露的脑部和病变腔出血应在下一步骤前停止。
2. 轻轻取出HBSS中的胚胎皮质组织，并用一对薄薄的镊子在HBSS中小心地切割一块胚胎皮质组织（约1毫米<3>）。将组织置于宿主大脑的病变腔内，使组织保持与宿主脑相同的方向。
  注意：如果有皮质组织残留物残留在病变腔外，请仔细清除碎屑。
3. 从24孔培养板中取出分离的骨瓣，并用一块高压灭菌的滤纸将其干燥，并在必要时清洁其上的任何碎屑。
  注意：确保使用与之前拆下的同一片骨瓣。
4. 用镊子握住骨瓣的边缘，轻轻盖住暴露的宿主脑。保持原来的方向，调整边缘，使其适合颅窗。用格列吡芬阻止任何出血。
5. 等到头骨的手术区域干燥。然后用牙签涂一小片Superglue，以密封围绕骨瓣的缝（图1C）。
  注意：请注意防止Superglue渗入宿主大脑。
6. 等待〜3分钟，直到分离的颅骨片紧紧地粘在颅骨上。缝合头皮，用碘酊消毒。将鼠标放回分离的笼子，并将动物体温保持在37°C，直到完全从麻醉中恢复。内源性小神经胶质细胞凋亡死亡，移植后36小时内出现细胞凋亡。
7. 移植组织的存活和分化可以使用活体成像或固定组织技术在不同的时间点从几小时到数周进行评估。我们观察到移植后移植组织内源性小胶质细胞（移植后1 h至36 h）迅速消失，移植后早期（从小时至1周），宿主脑小胶质细胞浸润到供体组织。宿主衍生的小胶质细胞的增殖持续至少一个月，最终恢复移植组织中的小胶质细胞群体。这些数据在我们最近发表的文章（ Scientific Reports 2016,6,33080）中报道。另一方面，移植组织的内源性神经元存活并将轴突和树突投射到宿主脑。在图2中，我们示出了将移植物从YFP H线转基因胎儿移植到成年野生型小鼠的脑中的例子。在这个例子中，嫁接组织的神经元在移植后2个月存活和分化，并将神经纤维投射到宿主脑（图2A-2C）。
  
  图2.胎儿皮层组织在宿主大脑中成功存活并分化。 A.移植组织中的神经元（绿色）可以在移植后2个月内在宿主脑中存活并分化，并且将大量的轴突和树突投射在嫁接组织和宿主脑。 Iba-1染色显示小胶质细胞（红色）均匀分布在移植组织和宿主脑中。白色虚线表示供体和受体组织之间的边界。公元前。分别在A中的黄色和白色盒区域的放大图，显示神经元突出的轴突（箭头）和树突（箭头）并且与小胶质细胞共存。移植的皮质组织来自YFP H线胎儿，宿主是野生型成年小鼠。

数据分析

通过固定脑切片的活体两光子成像或共焦成像检查移植组织的发育。通过评估来自胚胎组织的荧光标记的神经元的轴突和树突的投影来分析移植组织的分化。对于共聚焦成像，通过使用奥林巴斯共聚焦显微镜（FV1000）获得图像堆叠，并且通过使用ImageJ软件的Z Project功能（ http://rsb.info.nih.gov/ij ）。通过使用ImageJ的合并频道功能合并不同频道的图像。

笔记

为了提高移植手术的成功率，胎儿应尽快从安乐死的怀孕小鼠中提取。
在供体组织的制备过程中，通过将胚胎组织放入含有4℃HBSS的培养皿中来保持较低的温度。
移植手术后，每只宿主小鼠应在单独的笼中喂养以促进宿主动物的恢复。如果采取良好的照顾，接受者的典型生存率可能达到〜100％。移植手术的成功率为〜55％
圆形盖玻璃代替骨瓣可以胶合到颅骨窗口进行活体两光子成像。

食谱

氯胺酮 - 赛拉嗪混合物（KX）
20mg/ml氯胺酮
2 mg/ml甲苯噻嗪
溶于0.9％NaCl
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
1.4mM KH 2 PO 4
8.0mM Na 2 HPO 4在pH 7.4下进行灭菌并储存在冰箱中
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）
137 mM NaCl
2.5mM CaCl 2
1.0mM MgSO 4
5.0mM KCl
0.34mM Na 2 HPO 4
10.0mM Na +//- HEPES
1.0mM NaHCO 3
20.0 mM葡萄糖，pH 7.4 灭菌并储存在冰箱中
聚氨酯溶液
1.5克溶于10毫升水（超纯灭菌）

致谢

本研究得到国家自然科学基金（81171174,341471045）和高等教育博士生专项研究基金（SRFDP：20130211110002）的支持。该方法已经在我们最近的研究中使用（Wang等人，2016），并且它是对以前出版物中使用的方法的改编（Gaillard和Roger，2000; Gaillard等人，/em>。，2007）。

参考

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