材料和试剂

Spatula光滑的窄头和光滑的玻璃棒
塑料培养皿（60 x 15毫米）（康宁，目录号：351007）
塑料容器用湿Kimwipes内部湿度
纸巾或Kimwipe
在温室条件下，65-70°F生长在砂土和陶壶中的新生豌豆荚（长1.5-2.0厘米），新鲜收获（施用处理3小时后使用）。取出花萼并短暂保持在无菌水中（图1）。内果皮将用于测定（见详细说明1）
玻璃小瓶30 ml
候选激发剂溶液最好溶于去离子水中（例如见程序1）
DMSO
己烷
95％乙醇

设备

可调式移液器（P-200和P-1000及相应的提示）
烧瓶500毫升与5ml分配器顶部或5ml移液管用于分配己烷
玻璃烧杯，30 ml
用于病原体或诱导剂处理的室温暗柜空间（如步骤3b所述）
紫外光谱仪（Shimadzu，型号：UV160）
1厘米路径石英比色皿（Sigma-Aldrich，目录号：C5178）
注意：本产品已停产。

程序

诱导器的准备
激发器的选择是通过设计开放创新的。按照制造商的说明进行溶解度程序。在近中性pH下溶解的水溶性化合物是优选的。当溶解度取决于乙醇，DMSO等时，必须有合适的控制应用，只有相应的溶剂。不相容的病原体可以是非宿主抗性诱导物的阳性对照。详见附注2.
准备荚半部
1. 收获荚果并清除花萼，如图1所示。将这些荚放在无菌去离子水储存器中，以保持组织湿润。
2. 从水库选择一般尺寸和调理的豌豆荚。
3. 用平滑的铲子分离荚半部，尽可能避免受伤。
4. 确定荚半重量的重量。
5. 在培养皿中放置内果皮（内）表面层（图1）
  
  图1.豌豆内果皮未成熟豌豆荚的内层（内皮）是能够快速响应微生物或诱发剂化合物的无角质层组织。右图显示在培养皿中用诱导剂溶液处理的内皮组织。孵育在带有湿纸巾的塑料容器中进行，以保持湿度
诱发器的应用
1. 应用25μl引发剂候选溶液，并用玻璃棒轻轻分布在整个表面上。为了控制，应用与溶解激发剂相同的溶剂。
2. 处理的荚被保留在带湿纸巾的塑料容器中（图1）以保持湿度，然后在黑暗或中等光照下孵育长达24小时。
提取和测量靛红
1. 使用镊子将荚子转移到30ml玻璃小瓶中，并在黑暗中浸入5ml己烷中4小时。通常，每5ml己烷具有400mg鲜重
2. 将己烷倒入30ml烧杯中，并在低光下在发动机罩的气流中蒸发己烷，因为在明亮的光线中，因为靛红不稳定（通常实验室中的光强度不是白炽灯）。
3. 将1毫升95％乙醇加入到残留物中，并用分光光度计在比色杯中以309nm读数。
4. 为了确保纯度，在220-320nm的范围内测量UV光谱以验证特征性的美沙酮谱（图2）。详见附注3.
  
  图2.靛红色谱。测试在220-320nm范围内的紫外光谱，以验证皮沙汀的纯度。

数据分析

在减去未处理对照的OD 309值之后，根据以下等式转换数：1.0 OD 309单位=43.8μg/ ml在1cm光程中的美沙酮详见附注4）。数据应以每个鲜重的组织（g）的豌豆素量（μg）显示。所获得的数据应使用ANOVA进行分析，然后是Student's 测试。与 P 的区别0.05被认为是重要的。

笔记

豌豆内果皮组织具有一些潜力，可以在电子显微镜观察中检测到（例如，Hadwiger等人）检测到悬浮液中不溶性物质的小百分比，例如由真菌孢子释放的细胞壁碎片， 1981）
诱导子的作用可以与不相容的真菌病原体（例如，镰孢镰刀菌fssp. （Fsph）（Fsph）进行比较，豆的病原体（不是豌豆）。在图3中显示了一个示例性结果，其中数据显示在水处理的组织中没有可检测到的高于背景的皮屑素，以及由真菌壁碳水化合物（即，壳聚糖）诱导的美沙酮的积累以及由真菌壁碳水化合物豌豆中的非宿主抗性的真正诱导物，豆的真菌病原体（，Fsph）。
使用薄层色谱和质谱法（Teasdale等人，1974; Seneviratne等人，2015），从最终步骤中纯化靛蓝。该测定是准确的，因为只有在309nm处才能吸收靛红
乙酸中的靛红具有特征性紫外吸收光谱，在286 nm和309 nm处有两个峰（图2）。当靛红是溶液中唯一的光吸收化合物时，OD 309与OD 286之比为1.47（Cruickshank和Perrin，1961）。

图3.靛红测定的实例结果在与水（对照），1mg / ml壳聚糖（激发剂）或4个培养基孵育24小时后，从内切片（n = 3）中提取和测量茜素Fsph（镰孢镰刀菌fssp。相位柱）的孢子的X 10 。数据是从我们以前的出版物（Hartney等人，2006）修改的。通过单因素方差分析（p <0.05）确定组间平均值差异有统计学意义。

致谢

华盛顿州立大学维持农业和自然资源中心（CSANR）的生物强化农业和有机农业（BIOAg）补助金部分得到了这项工作的支持。 PPNS第0740号，农业，人力和自然资源科学学院农业研究中心植物病理学系，华盛顿州立大学哈尔滨工程WNP01844，铂尔曼，99164-6430，美国。

参考

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