材料和试剂

无菌手术手套
10毫米皮肤穿孔活检器械（Acu-Punch活检冲孔10毫米）（Acuderm，目录号：P1025）（图2）

图2.一个10毫米穿孔活检仪
Ethilon不可吸收尼龙缝线，5-0 PC-3（Ethicon，目录号：1965G）
无菌手术毛巾悬垂（Steri-drape）（3M，目录号：1010）
无菌手术纱布（4 x 4 Gauze 8 Ply）（COVIDIEN，Dermacea ^{TM，目录号：441001）}
酒精垫（WebCol Alcohol Prep）（COVIDIEN，目录号：6818）
331/5000 供体小鼠（雌性，6-8周龄转基因小鼠，参见转基因小鼠的生成：Sun JF，Phung T，Shiojima I，Felske T，Upalakalin JN，Feng D，Kornaga T，Dor T，Dvorak AM，Walsh K，Benjamin LE.Microvascular patterning is controlled by fine-tuning the Akt signal.Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102：128-33）
受体小鼠（雌性，来自Charles River Laboratories的6-8周龄的nu / nu小鼠，目录号：490）
异氟烷（Sigma-Aldrich，目录号: CDS019936)
磷酸盐缓冲盐水（PBS），1x无菌溶液（AMRESCO，目录号: K812)

设备

针座（Halsey锯齿）（Roboz Surgical Instrument，目录号：RS-7841）
精细单齿镊子（微解剖镊子图案7）（Roboz手术器械，目录号：RS-5047）
手术剪刀（微解剖剪刀）（Roboz Surgical Instrument，目录号：RS-5910）
电动剃须刀（Wahl电池操作紧凑型旅行微调器）
升温板（Ala Science，目录号：TCW220x120）

步骤

重要提示：在进行动物皮肤移植手术之前，必须获得适当的机构动物护理和使用委员会（IACCU）的批准.

用异氟烷麻醉气体麻醉供体和受体小鼠。供体动物通常镇静5-10分钟，同时执行穿刺活组织检查和去除供体皮肤。受体动物通常镇静20-30分钟，同时将两个皮肤移植物缝合到位。当它们不显示对脚垫的捏合的反应时，动物被充分镇静。
对于供体老鼠，选择一个皮肤区域，从皮肤将被摄取。在我们的研究中，我们选择了背部皮肤，因为皮肤将被移植到受体鼠标背部的同一解剖部位。
将头发刮去皮肤移植物的皮肤区域。小心避免划伤或伤害皮肤表面（图3和视频1）。

图3.从供体小鼠中去除皮肤的冲击的步骤。 A-B。将头发刮去皮肤移植物的皮肤区域。 C.握住皮肤稍微伸展，并将10毫米打孔器垂直放置在拉伸皮肤的顶部。 D.轻轻旋转打孔仪器，直到冲头穿过皮肤。一旦冲头穿过皮肤，取下冲头。F-G。切出一块穿孔的皮肤和下面的皮下组织，并将皮肤放在一块无菌纱布上，浸泡在无菌磷酸盐缓冲盐水中以保持皮肤湿润。皮肤真皮侧面向上的主机皮肤打孔的特写照片如图G所示。

Video 1. Skin graft procedure
将动物放在用无菌手术罩覆盖的清洁表面上。
用70％的酒精擦拭垫彻底清洁供体动物的剃光皮肤。
握住皮肤稍微拉伸，并将10 mm打孔器垂直放置在拉伸皮肤的顶部。轻轻地旋转打孔仪器，平滑360°转动，同时施加向下的压力，直到冲头穿过皮肤（也参见Levitt等人，2013年的技术视频演示）。
一旦穿孔穿过皮肤并通过真皮和皮下组织达到大约1-2毫米的最大深度，则取下冲头。用无菌的精细手术剪刀剪下一块穿孔的皮肤和下面的皮下组织。
用无菌细镊子轻轻取出皮肤碎片。镊子通过高压灭菌灭菌。请注意，去除皮肤时，请小心，以避免通过用精细的单齿镊子拾取边缘的组织片来进行粉碎。保存穿孔皮肤，将其嫁接到受体鼠标的背面。通过将皮肤移植物浸泡在浸泡在1x无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中的无菌纱布上，使皮肤移植物变湿。
通过用干燥的无菌手术纱布在切割区域上施加温和的压力可以实现止血。一旦这一步骤完成，供体动物可以立即按照经批准的机构动物保护和使用委员会（IACCU）方案进行安乐死。
对受体鼠标重复相同的穿刺活检程序。从接收鼠标的背面打出10毫米的圆形皮肤。切下皮肤碎片和下面的皮下组织并丢弃（图4和视频1）

图4.将供体皮肤缝合到受体小鼠上的步骤。 A-B。使用如图3所示的打孔装置从接收鼠标的背面取下一块皮肤。C.将供体皮肤碎片放入受体鼠标的穿孔区域。D--G。将供体皮肤片段缝合到位。
用无菌手术纱布对切割区域施加温和的压力，以止血。
将供体皮肤碎片放在受体鼠标背部的穿孔区域中。
为了帮助将皮肤移植物定位到位，请使用圆形皮肤打孔机作为时钟面。首先，在12点，3点，6点和9点钟位置放置缝合针迹。然后在1:30,4:30，7:30和10:30的位置添加缝合线。用不可吸收的尼龙缝合线将皮肤片段缝合到位。执行双重结结，以将缝合线固定到位。
完成后，用无菌PBS溶液浸泡无菌纱布轻轻擦拭缝合区域。
将动物在37°C的加温板上观察，直到其完全清醒和移动，通常需要约10-15分钟。动物通常在麻醉撤回后醒来并开始移动，因此需要持续观察，直到动物完全清醒。一旦动物完全清醒并可以移动，它可以放置在笼子里，用干净的笼子寝具，水和食物（在笼子地板上放置几个食物颗粒，使动物可以在头1-2天内轻松饲养程序）。
每天监测动物的伤口感染迹象，并证明愈合和伤口闭合（图5D）
缝合线可以在外科手术后10-14天取出，大约是完成皮肤伤口愈合所需的时间。
成功的皮肤植入是明显的，因为移植的供体皮肤变成粉红色，皮肤移植物中有毛发生长（图5D）。
注意：可以在本文附带的视频中查看整个过程的详细演示。关于如何进行皮肤穿刺活检的其他信息也可以从Levitt等人，2013年的视频参考中获得。

数据分析

使用这种皮肤移植模型研究内皮Akt1对血管肿瘤形成的影响，我们发现组成型激活的Akt1的过表达4周导致皮肤移植部位的红肿发展，测量为0.39±0.14cm < 3（图5和图6）（参见Phung等人，2015年的图3），其大小具有血管肿瘤的组织学特征。肿瘤切片的免疫荧光染色显示肿瘤血管表达内皮标志物CD31（图6D）。对于免疫荧光染色，将新鲜组织固定在冷的4％多聚甲醛中，在5％山羊血清中封闭1小时，并与抗CD31抗体（BD Biosciences MEC13.39）在4℃下孵育过夜，然后孵育1小时与Dylight 488-缀合的二抗（Jackson ImmunoResearch Labs）。关于免疫荧光染色技术和皮肤移植物肿瘤分析的更详细信息在原始出版物（从Phung等人，2015年改编）中呈现。

图5.内皮myrAkt1驱动的血管肿瘤的小鼠模型。 A.血管瘤myrAkt1皮肤移植模型的示意图。 FVB背景中的转基因供体小鼠在内皮细胞中表达肉豆蔻酰化的活化的Akt1（myrAkt1）的诱导型表达。来自myrAkt1小鼠（绿色圆圈）的皮肤用作nu / nu受体小鼠中的皮肤移植供体。将来自供体小鼠的10-mm活组织检查皮肤移植到宿主（受体）小鼠的背部皮肤上。允许移植物治愈2周，此时一半的受体小鼠被取出四环素（给予普通饮用水）以开启myrAkt1，另一半保留在四环素上以关闭myrAkt1 4周。 B.在第0天（箭头），接受者nu / nu小鼠的照片在缝合处显示新鲜的皮肤移植物。 C.小鼠的照片6周后，皮肤移植物中出现毛发生长成功的皮肤植入（黑色箭头表示移植部位的白色毛发）。在myrAkt1关闭的受体小鼠的皮肤移植部位没有肿瘤块，但在myrAkt1 ON的受体小鼠的皮肤移植部位存在红色肿瘤块（参见红色箭头）。 D.成功的皮肤植入是通过供体皮肤移植物的愈合而显而易见的，并且移植的皮肤在移植部位变成粉红色的毛发生长（参考文献：Phung，TL，Du，W.，Xue，Q.，Ayyaswamy，S.，Gerald ，D.，Antonello，Z.Nhek，S.，Perruzzi，CA，Acevedo，I.，Ramanna-Valmiki，R.，Rodriguez-Waitkus，P.，Enayati，L.，Hochman，ML，Lev，D. ，Geeganage，S。和Benjamin，LE（2015），Akt1和akt3在血管肿瘤生长调节中发挥相反作用。癌症研究75（1）：40-50）。

图6.内皮myrAkt1激活驱动体内的血管肿瘤形成。A.在移植部位存在白毛的存在看，在nu / nu受体小鼠中移植的供体小鼠皮肤。在myrAkt1诱导后监测皮肤移植物中的血管肿瘤发展。肿瘤在myrAkt1诱导后4周在皮肤移植中发育。放大倍数X1。 B.显示肿瘤肿块的肿瘤的微观特征（箭头）。 C.肿瘤包括在真皮中充满红细胞的多个血管（箭头）。血管具有不规则尺寸和不规则管腔，血管壁较薄。 D.肿瘤由多种血管组成，如CD31免疫荧光染色（绿色）所示。细胞核用Hoechst染料（蓝色）染色。

笔记

在我们的经验中，几乎所有的皮肤移植手术成功地成功地植入了供体皮肤。我们没有观察到移植部位的动物死亡或皮肤感染。因为免疫缺陷的nu / nu受体小鼠被用作移植物接受者，我们的研究中没有移植排斥证据。

致谢

这项工作部分由NIH授权R01CA106263和P01CA09264401（LE本杰明），美国心脏协会11BGIA5590018，NIH K08 HL087008，NIH R03 AR063223，美国癌症协会122019-RSG-12-054-01-CSM以及贝勒临床与转化研究计划（至TL Phung）。

参考

Levitt, J., Bernardo, S., Whang, T. (2013). 临床医学影像。如何进行皮肤穿孔活检. N Engl J Med 369(11): e13.
Phung, T. L., Du, W., Xue, Q., Ayyaswamy, S., Gerald, D., Antonello, Z., Nhek, S., Perruzzi, C. A., Acevedo, I., Ramanna-Valmiki, R., Rodriguez-Waitkus, P., Enayati, L., Hochman, M. L., Lev, D., Geeganage, S. and Benjamin, L. E. (2015). Akt1和akt3在血管肿瘤生长调节中起反作用. Cancer Res 75(1): 40-50.
Sun, J. F., Phung, T., Shiojima, I., Felske, T., Upalakalin, J. N., Feng, D., Kornaga, T., Dor, T., Dvorak, A.M., Walsh, K. and Benjamin, L. E. (2005). 通过微调Akt信号来控制微血管图案化. Proc Natl Acad Sci U S A 102(1): 128-33.