材料和试剂

防护眼戴/安全眼镜/面罩
移液器提示
带有O形环的2ml螺旋盖管（例如，SARSTEDT，目录号：72.694.406或72.694.217）
微孔板密封带（例如，Corning铝带，Corning，目录号：6570）
QuickSeal Foil PCR自粘密封（Biosero）
或4t PCR聚酯箔密封（4份，目录号：4ti-0550）
或可剥离热封箔密封件和热封机
对于96孔微量滴定板测定
一个。聚丙烯，圆底96孔板，360微升容量（例如Corning，目录号：3359）
湾聚苯乙烯，平底96孔板（用于读板机）（例如，Corning，目录号：3370和3915）
酵母细胞
注意：本协议已针对酿酒酵母开发。它没有被其他种类的酵母尝试，但应该工作。
Milli-Q或双蒸水
葡萄糖测定试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：GAGO-20）
硫酸
冰醋酸
醋酸钠三水合物*
黑曲霉α-淀粉葡萄糖苷酶（Biochemika，〜70U / mg）（Sigma-Aldrich，目录号：10115）
或者：120U / mg，可以是更高的纯度（Sigma-Aldrich，目录号：10113）。
猪海藻糖酶（约2.3U / ml）（Sigma-Aldrich，目录号：T8778）
浓H 2 SO 4（硫酸）*
无水碳酸钠（Na 2 CO 3）*
1M乙酸（参见食谱）*
0.2 M醋酸钠，pH 5.2（参见食谱）
0.2 M醋酸钠，〜pH 8（见配方）
96孔微量滴定板测定

浓缩淀粉葡糖苷酶缓冲液（参见食谱）
浓缩海藻糖酶缓冲液（参见食谱）
海藻糖酶稀释缓冲液（0.1M乙酸钠，pH 5.7）（参见食谱）

9 N H 2 SO 4（见配方）
0.25 M Na 2 CO 3（参见食谱）

注意：*任何合格公司的试剂都适合本实验。

设备

用于生长酵母的滚筒或摇床
可调节的微量移液器，体积从2到500μl
分光光度计和比色皿
离心机（室温或冷藏）体积为5至15 ml
微量离心机用于1.5和2ml管子
涡街搅拌机
pH计
水浴（95°C）
水浴或空气培养箱，57°C和37°C
玻璃移液器
通风柜
96孔平板测定

微量滴定板离心机和适配器
多通道移液器
读板器

注意：所有这些项目都可以从任何合格的公司订购。

程序

糖精和海藻糖测量在2毫升螺旋盖管中注意：方法基于Becker，1978; Parrou和Francois，1997.
1. 仔细测量细胞浓度（例如，使用库尔特计数器或分光光度计中的光散射），并注意到。将含有5.0×10 7个细胞的样品（必需不同的仔细测量的体积）或如果有的话，将1.0×10 8个细胞转移到2ml螺杆并以约20,000×g离心10秒钟。（例如，在Eppendorf 5415 D）中，在室温下以最大速度[〜16,000rpm] 10秒钟）。
2. 取出上清液，用1ml冰冷的水清洗细胞沉淀，以从培养基中除去残留的葡萄糖。将细胞沉淀重新悬浮在125μl0.25M Na 2 CO 3溶液中，初步剧烈/剧烈涡旋以使所有细胞充分分散，并在95℃下孵育约3小时偶尔涡旋（〜每小时一次，5秒），小心保持管顶部的温度，以避免过度冷凝。
  注意：这可以通过在封闭的水浴中孵育管来完成，使得管上方的空气为〜95℃。有些更长或更短的孵化对结果没有明显的影响; Becker（1978）和Quain（1981）仅孵育90分钟。在稍后的时间，碱处理的细胞倾向于聚集在一起并且难以分散，但是在这些晚期不能分散细胞对结果没有明显的影响。
3. 在95℃下温育后，通过加入75μl1M乙酸和300μl0.2M乙酸钠（pH5.2）（醋酸和乙酸钠的合适混合物）先调节pH至5.5，体积至0.5ml ，然后将375μl混合物加入到125μl样品中）。
4. 将样品剧烈旋转以重悬和分散细胞碎片，然后立即将其分成新鲜管中的两个250μl，分别用于糖原和海藻糖测量。
  注意：细胞碎片平均分配可能很重要，因为透化细胞可能仍然含有糖原颗粒，葡萄糖在糖原测定中由淀粉葡糖苷酶释放出来。
5. 对于糖原测量，在0.2M的乙酸钠（pH 5.2）中新鲜制备20mg / ml黑曲霉α-淀粉葡萄糖苷酶（〜70U / mg）的溶液。（酶的pH最佳值为〜pH 5，但pH 3.0和pH 6.5之间具有较高的活性[Pazur and Ando，1959]）。加入10μl该溶液至250μl样品。将混合物在57℃下孵育过夜，接近温度最佳，偶尔涡旋方便。
  注意：孵化的确切长度对结果几乎没有明显的影响。然而，在低于55℃的温度下孵育可能允许淀粉葡糖苷酶中的污染海藻糖酶活性变得活跃，并从海藻糖释放葡萄糖，导致对糖原量的过度估计（Parrou和Francois，1997）。 >
6. 对于海藻糖测量，通过加入15μl0.2M的乙酸钠（通过将NaAcetate三水合物溶解在水中，pH8）制成）向250μl样品中调节pH稍微升高。猪海藻糖酶的pH最适pH约为5.8。加入3μl猪海藻糖酶（2.27U / ml）（即，加入约0.007U海藻糖酶）并充分混合。将混合物在37℃下孵育过夜。
7. 使用葡萄糖测定试剂盒对上述程序释放的葡萄糖进行定量。
  一个。简言之，如制造商所述制备葡萄糖氧化酶/过氧化物酶/邻联茴香胺试剂。
  湾离心细胞样品5分钟以沉淀细胞碎片。
  C。将100μl测定试剂从细胞样品中混合50μl上清液，并将混合物在37℃的预热架中孵育30分钟。
  天。然后向每个反应中小心地加入100μl的9 N H 2 O 3 SO 4，以停止反应并显色（参见方案4）。
8. 在0.2M乙酸钠缓冲液pH 5.2中制备50μl葡萄糖标准品（0,0.5,1,1.5,2,2.5,3,4,5μg葡萄糖）样品，并平行测定。通常准备四个或更多的“空白”（0葡萄糖）标准品。最后，测量540纳米的吸光度
9. 如果A540读数为> 100，样品将被稀释并重新开发。 0.5以上，高分子量非常非线性。使用标准曲线将A540读数转换为绝对量的葡萄糖，并对样品中使用的细胞数进行标准化。
在96孔微量滴定皿中测定糖原和海藻糖
1. 对于大量的测定，上述方案已经适应于96孔微量滴定皿。仔细测量细胞浓度（例如，使用库尔特计数器或分光光度计中的光散射），并注意到。转移含有5.0×10 7个细胞的样品（必需不同的仔细测量的体积），或者如果有的话，将其转移到小于250μl的1.0×10 8个细胞中的液体进入聚丙烯96孔板的孔（〜360μl）中。离心板并吸出上清液。在250μl冰冷的水中洗涤细胞沉淀物一次以除去残留的葡萄糖。离心后，通过抽吸去除上清液
2. 将细胞沉淀重悬于125μl的0.25M Na 2 CO 3溶液中。用可剥离的PCR箔微量滴定盘密封膜（例如，QuickSeal Foil PCR Self Adhesive Seal [Biosero]或4t PCR聚合物箔密封）密封板（参见注释）。用手摇动密封的板，然后按下涡旋混合器，彻底分散所有的细胞
3. 将板在95℃孵育约3小时，偶尔涡旋，注意保持板顶部的温度，以避免过度冷凝。这可以通过在封闭的水浴中孵育板来实现，使得板上方的空气为〜95℃。
  注意：聚苯乙烯板不应在此温度下使用。在稍后的时间，碱处理的细胞倾向于聚集在一起并且难以分散，但是在这些晚期不能分散细胞对结果没有明显的影响。
4. 在95℃温育后，将板冷却至室温。在将内容物分配到新的96孔板中以便用淀粉葡糖苷酶或海藻糖酶处理之前，立即将板猛烈摇动并涡旋以分散细胞碎片，然后点击台面将液体带到孔的底部，然后开封。
5. 对于糖原测定，向96孔板的每个孔中加入188μl浓缩的淀粉葡糖苷酶缓冲液（参见Recipes）。将62μl（一半）热和碱处理的新鲜摇动的细胞悬浮液吸入每个孔中。将细胞碎片平均分配可能是重要的，因为透化细胞可能仍然含有一些糖原颗粒，糖原测定中葡萄糖将由淀粉葡糖苷酶释放出来。
6. 新鲜将20mg / ml的黑曲霉α-淀粉葡萄糖苷酶（〜70U / mg）溶液在0.2M的乙酸钠缓冲液（pH 5.2）中制备。向已经在每个孔中的250μl添加10μl黑曲霉α-淀粉葡萄糖苷酶（〜70U / mg）溶液（步骤B3）。使用普通铝箔密封（例如，Corning铝胶带）密封板（参见注释），并猛烈摇动并涡旋混合。在57℃孵育板过夜，偶尔涡旋方便，小心地在板的顶部保持高温以防止冷凝（例如，通过将整个板放置在水浴中或空气培养箱。
  注意：孵化的确切长度对结果几乎没有明显的影响。然而，在低于55℃的温度下孵育可能允许淀粉葡糖苷酶中的污染海藻糖酶活性变得活跃，并从海藻糖释放葡萄糖，导致对糖原量的过度估计（Parrou和Francois，1997）。 >
7. 对于海藻糖测定，向96孔板的每个孔中加入188μl浓缩的海藻糖酶缓冲液（参见食谱）。将62μl（一半）热和碱处理的新鲜摇动的细胞悬浮液吸入每个孔中。在海藻糖酶稀释缓冲液（见材料和试剂）中将猪海藻糖酶（2.27U / ml）稀释至约0.7U / ml，稀释的酶（即约0.007U海藻糖酶）加入到每个孔中。用普通箔片密封板（例如，Corning铝胶带）（见注释），然后猛烈摇动并旋转。在37℃孵育板过夜。
8. 使用葡萄糖测定试剂盒对上述程序释放的葡萄糖进行定量。如制造商所述，制备葡萄糖氧化酶/过氧化物酶/邻联茴香胺试剂。
  1. 向新鲜的96平底井聚苯乙烯板（即，适用于平板读数器的板，参见材料和试剂）的每个孔中加入100μl该试剂。
  2. 将含有细胞样品的96孔板离心5分钟以沉淀细胞碎片。将细胞样品中的50μl上清液吸取到测定板中的100μl测定试剂中。密封板，并通过剧烈摇晃和涡旋混合。
  3. 将混合物在37℃的水浴中孵育30分钟。开封板，然后小心地向每个孔中加入100μl9N H 2 O 3 SO 4，以停止反应并显色。
    注意：混合可以通过上下移动来完成;或者，由于孔中的硫酸，板可以被再密封并摇动/涡旋，但要小心（例如，在包裹在纸巾中之后）。
  4. 使用读板器测量540纳米的吸光度。（见配方4）
9. 在0.2M醋酸钠pH 5.2中制备50μl葡萄糖标准品（0,0.5,1,1.5,2,2.5,3,4,5μg葡萄糖）样品，并并行测定。通常制备和测定四种或更多的“空白”（0葡萄糖）标准（Zhao等人，2016）。
10. 如果A540读数为> 100，样品将被稀释并重新开发。 0.5以上，测定是非线性的。使用标准曲线将A540读数转换为绝对量的葡萄糖，并对样品中使用的细胞数进行标准化。

数据分析

线性回归用于将线拟合到标准曲线的线性部分;在该分析中不使用非线性范围（较高葡萄糖量）的点。线性回归线用于将样本的读数转换为葡萄糖的绝对量。从原始样品中的细胞数量（这里为5×10 ^{7 或1×10 ^{8 ）的知识，以及使用的样品的分数的知识最终颜色测定（对于2ml管糖原测定，50/260 = 0.192），每个细胞的碳水化合物的量可以以ng或pg的葡萄糖当量计算。分析的两个关键点是准确了解起始样品中细胞数量;并在线性范围内使用测量。}}

笔记

这些测定是非常稳定的，因为结果并没有显着改变，因为培养时间或温度的微小或甚至中度变化，甚至添加的试剂的确切体积。但是，至少有一些淀粉葡萄糖苷酶的制备，培养温度必须高于55℃，以避免污染海藻糖酶的活性。通过使用淀粉葡糖苷酶海藻糖的特定制剂，可以发现污染海藻糖酶活性的量的指示，然后测定产生多少葡萄糖。
我们还没有问过碱处理后残留的细胞残留物是否还含有糖原。这可以通过在碱处理后离心细胞悬浮液，并分别测定上清液和沉淀糖原来进行。如果颗粒级分中糖原少，则可以通过碱步骤离心来提高方案，只使用上清液。
将密封保持在96孔培养皿中，在95℃孵育3小时可能是具有挑战性的。具有热封箔带的热封机提供了坚固的密封，但是热封件是昂贵的并且并不总是可用的。如果仔细应用，粘合剂PCR箔片胶带（例如，QuickSeal Foil PCR Self Adhesive Seal [Biosero]或4t PCR聚合物箔密封）就足够了。如果拆除外部矩形凸缘的第二个圆底96孔盘定位在样品板的箔密封件的顶部，则常规箔密封胶带（例如，Corning）将起作用，以及使用顶板的96个空孔将样品板的箔片密封压下并保持压力。压力可以用C型夹具或重量保持3小时。在进行实验之前，应在95℃下测试箔密封和微量滴定皿的任何特定组合。
在将缓冲液与样品混合之前，通过将酶（淀粉葡糖苷酶或海藻糖酶）与缓冲液混合可以节省移液步骤。然而，我们还没有测试这些酶在这些缓冲液的相对低的pH下是否稳定
不能合成糖原或不能合成海藻糖的菌株（Zhao等人，2016）可用作测定的阴性对照。生长至固定相的野生型细胞可作为阳性对照

食谱

1M乙酸
加入1ml冰醋酸（17.4M）至16.4ml ddH 2 O→/
0.2 M醋酸钠缓冲液，pH 5.2
将2.05g无水乙酸钠溶于75ml的ddH 2 O烧杯中。搅拌（磁力搅拌器）时，使用1M乙酸和pH计将pH调节至5.2。将最终体积调整为100 ml
0.2 M醋酸钠（〜pH 8）
将2.05g无水乙酸钠溶于75ml的ddH 2 O烧杯中。将最终体积调整为100 ml
浓缩淀粉葡糖苷酶缓冲液
每96孔板中混合3.7ml 1M乙酸与15.1ml 0.2M乙酸钠，pH5.2
浓缩海藻糖酶缓冲液
每96孔板中混合1.5ml 0.2M乙酸钠（pH〜8），3.7ml 1M乙酸和15.1ml 0.2M乙酸钠，pH5.2
海藻糖酶稀释缓冲液（0.1M乙酸钠，pH 5.7）将1.025g无水乙酸钠溶于75ml ddH 2 O的烧杯中。搅拌（磁力搅拌器）时，使用1M乙酸和pH计将pH调节至5.7。将最终体积调整为100 ml
9 N H 2 SO 4
1体积浓缩的H 2 O 3 SO 4稀释至4体积的终浓度
注意：9 NH 2 SO 4 em高度放热，需要护理和保护眼睛和其他设备。它应该在通风橱里完成。在搅拌下将少量酸缓慢加入水中。将容器中的酸和水混合指向远离实验者。戴眼睛保护不要使用聚苯乙烯移液管来加酸，因为产生的热量足以使聚苯乙烯移液管熔化/变形。
0.25M Na 2 CO 3
将2.85g无水Na 2 CO 3溶于90ml ddH 2 O中。使体积达到100 ml

致谢

这项工作由NIH RO1 GM 119175资助。

参考

Becker，JU（1978）。＆nbsp; 糖原测定方法在整个酵母细胞中。 Anal Biochem 86（1）：56-64。
Pazur，JH和Ando，T.（1959）。＆nbsp; 淀粉和麦芽低聚糖上黑曲霉的淀粉葡糖苷酶的作用.J Biol Chem 234（8）：1966-1970。
Parrou，JL和Francois，J.（1997）。＆nbsp; 用于在全酵母细胞中糖原和海藻糖的快速和可靠测定的简化程序。 248（1）：186-188。
Plata，MR，Koch，C.，Wechselberger，P.，Herwig，C.and Lendl，B。（2013）。＆nbsp; 使用中红外光谱和偏最小二乘回归确定酿酒酵母中存在的碳水化合物。 Anal Bioanal Chem 405（25）：8241-8250。

Quain，DE（1981）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1981.tb04038.x/abstract”target =“ _blank“>确定酵母中的糖原。 JI酿造 87：289-291。

Schulze，U.，Larsen，ME和Villadsen，J。（1995）。酿酒酵母中细胞内海藻糖和糖原的测定。 Anal Biochem 228（1）：143-149。

Trevelyan，WE和Harrison，JS（1956a）。研究对酵母代谢。 5.厌氧发酵过程中面包酵母的海藻糖含量。生物化学J 62（2）：177-183。

Trevelyan，WE和Harrison，JS（1956b）。＆nbsp; 研究对酵母代谢。酵母碳水化合物。在厌氧发酵过程中与核酸，分析和行为分离。生物化学J 63（1）：23-33。

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