材料和试剂

移液器提示（更喜欢使用过滤器以最大限度地减少污染，例如来自Denville Scientific）
管（Denville Scientific，目录号：C2170）
培养皿（Corning，Falcon ^®，目录号：351029）
NEB 5-alpha Electrocompetent E。大肠杆菌（New England Biolabs，目录号：C2989K）
逆转录病毒载体pSUPER-CRISPR含有嘌呤霉素选择标记和U6启动子，以驱动在HindⅢ位点上克隆的sgRNA的表达（详见参见Cheng等人，2016b）。
注意：请写信请求本材料。
T4 DNA连接酶，2000,000 U/ml（New England Biolabs，目录号：M0202T）。用于需要T4 DNA连接酶在小体积中过量的连接，如步骤2中所述的
T4 DNA连接酶在40万U/ml（New England Biolabs，目录号：M0202S）
T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201S）
蒸馏水（AmericanBio，目录号：AB02123-00500）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
琼脂糖（AmericanBio，目录号：AB00972）
溴化乙锭，10mg/ml（Sigma-Aldrich，目录号：E1510）
3 M醋酸钠，pH 5.2
100％乙醇（AmericanBio，目录号：AB00515-00500）
70％乙醇（AmericanBio，目录号：AB04010-00500）
1kb加DNA标准品（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10787018）}
琼脂糖，低熔点（AmericanBio，目录号：AB00981）
10 bp DNA标准品（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10821015）}
NEBNext End Repair Module（New England Biolabs，目录号：E6050S）
10,000x SYBR安全DNA凝胶染色剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：S33102）}
QIAEX II凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：20021）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
p15I-接头寡核苷酸对：有义的aaaactcgag cagcag tggatccG和反义/5phos/Cggatcca ctgctg ctcgag（Integrated DNA Technologies; 25nmole DNA小规模;标准脱盐净化）。反义寡核苷酸具有5'-磷酸酶修饰物
100 bp DNA标准品（New England Biolabs，目录号：N3231S）
P P15I酶（New England Biolabs，目录号：R0646L）
PCI：苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，用TE（10mM Tris，pH8.0,1mM EDTA）饱和（Sigma-Aldrich，目录号：P2069-100ML）
用Tris饱和的酚，pH7.5（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：17914）}
氯仿（AmericanBio，目录号：AB00350-00500）
PCI（苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1），Tris饱和（Roche Diagnostics，目录号：03117944001）
3'sgRNA骨架衔接子寡核苷酸对：sense/5phos/nngttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-ttttttatactctatat和anti-sense ataaagcttaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataac-ggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaac（Integrated DNA Technologies，100nmole DNA oligo scale，Standard desalting purification）。敏感寡核苷酸具有5'-磷酸酶修饰
HI-HF酶（New England Biolabs，目录号：R3136S）
dIII-HF酶（New England Biolabs，目录号：R3104S）
MiniElute凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28604）
LB培养基（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：12795027）}
QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27104）
用于克隆sgRNA的Sanger测序中的寡核苷酸：ctccctttatccagccctca（Intergatred DNA Technologies，25nmole DNA oligo scale，Standard desalting purification）
氨苄青霉素（AmericanBio，目录号：AB00115-00100）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：EDS-100G）
冰醋酸（Sigma-Aldrich，目录号：695092）
琼脂（AmericanBio，目录号：AB01185-00500）
50x TAE凝胶运行缓冲液（见配方）

材料和试剂

移液器提示（更喜欢使用过滤器以最大限度地减少污染，例如来自Denville Scientific）
管（Denville Scientific，目录号：C2170）
培养皿（Corning，Falcon ^®，目录号：351029）
NEB 5-alpha Electrocompetent E.大肠杆菌（New England Biolabs，目录号：C2989K）
逆转录病毒载体pSUPER-CRISPR含有嘌呤霉素选择标记和U6启动子，以驱动在HindⅢ位点上克隆的sgRNA的表达（详见参见Cheng等人，2016b）。注意：请写信请求本材料。
T4 DNA连接酶，2000,000 U/ml（New England Biolabs，目录号：M0202T）。用于需要T4 DNA连接酶在小体积中过量的连接，如步骤2中所述的
T4 DNA连接酶在40万U/ml（New England Biolabs，目录号：M0202S）
T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201S）
蒸馏水（AmericanBio，目录号：AB02123-00500）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
琼脂糖（AmericanBio，目录号：AB00972）
溴化乙锭，10mg/ml（Sigma-Aldrich，目录号：E1510）
3 M醋酸钠，pH 5.2
100％乙醇（AmericanBio，目录号：AB00515-00500）
70％乙醇（AmericanBio，目录号：AB04010-00500）
1kb加DNA标准品（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10787018）}
琼脂糖，低熔点（AmericanBio，目录号：AB00981）
10 bp DNA标准品（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10821015）}
NEBNext End Repair Module（New England Biolabs，目录号：E6050S）
10,000x SYBR安全DNA凝胶染色剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：S33102）}
QIAEX II凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：20021）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
p15I-接头寡核苷酸对：有义的aaaactcgag cagcag tggatccG和反义/5phos/Cggatcca ctgctg ctcgag（Integrated DNA Technologies; 25nmole DNA小规模;标准脱盐净化）反义寡核苷酸具有5'-磷酸酶修饰物
100 bp DNA标准品（New England Biolabs，目录号：N3231S）
P

P15I酶（New England Biolabs，目录号：R0646L）
PCI：苯酚：氯仿：异戊醇25：24：1，用TE（10mM Tris，pH8.0,1mM EDTA）饱和（Sigma-Aldrich，目录号：P2069-100ML）
用Tris饱和的酚，pH7.5（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：17914）}
氯仿（AmericanBio，目录号：AB00350-00500）
PCI（苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1），Tris饱和（Roche Diagnostics，目录号：03117944001）
3'sgRNA骨架衔接子寡核苷酸对：感测/5phos/nngttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-ttttttatactctatat和反义ataaagcttaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataac-ggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaac（集成DNA技术，DNA 100nmole寡规模，标准脱盐纯化）敏感寡核苷酸具有5'-磷酸酶修饰
HI-HF酶（New England Biolabs，目录号：R3136S）
dIII-HF酶（New England Biolabs，目录号：R3104S）
MiniElute凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28604）
LB培养基（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：12795027）}
QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27104）
用于克隆sgRNA的Sanger测试中的寡核苷酸：ctccctttatccagccctca（Intergatred DNA Technologies，25nmole DNA oligo scale，Standard desalting purification）
氨苄青霉素（AmericanBio，目录号：AB00115-00100）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：EDS-100G）
冰醋酸（Sigma-Aldrich，目录号：695092）
琼脂（AmericanBio，目录号：AB01185-00500）
50x TAE凝胶运行缓冲液（见配方）

程序

对于大的DNA片段，例如BAC克隆，从步骤6开始。如果输入DNA很小并且由多个片段组成，例如单独的PCR产物，则通过NanoDrop 2000定量纯化的DNA片段并以相等的摩尔比合并。 br />
如果使用多片DNA的输入池，则随机连接较大的产物，然后使用T4 DNA连接酶过量产生。具体地说，对于每μgDNA，将DNA库与4,000U T4 DNA连接酶（New England Biolabs）在50μl反应中在37℃下连接3小时。我们从约5μg磷酸基团的总DNA约20μg开始。
注意：添加此步骤以避免偏离输入DNA片段末端附近的区域（因为我们在此片段化步骤之后进行大小选择，并且接近末端的序列将在碎片后由非常小的片段表示），因此在最终图书馆中的代表性不足）。
如果直接使用PCR产物，则在使用T4多核苷酸激酶（TPK）进行连接之前进行激酶反应。具体来说，我们遵循制造NEB的方案，该反应由300 pmol的PCR DNA，5μl的10x缓冲液，5μl的10mM ATP和1μl（10U）的T4 PNK组成，并补充蒸馏水至总计50将反应物在37℃下孵育30分钟，然后在65℃灭活20分钟。磷酸化反应中的DNA然后通过QIAGEN PCR DNA纯化试剂盒纯化，并在连接前在50μl蒸馏水中洗脱。
在1x TAE缓冲液中，用0.5μg/ml溴化乙锭在1％琼脂糖凝胶上运行10μl或200ng连接产物，以检查连接产物的大小（平均通常> 10kb）。
通过乙醇沉淀纯化连接的大量DNA。加入10％体积的3M乙酸钠，pH 5.2和2体积的100％乙醇;混合，然后在-20℃下沉淀1小时;使用预冷微量离心机旋转10分钟，用70％乙醇洗涤;空气干燥1分钟;并在150μl水中重新悬浮。
为了产生随机DNA片段，在S220聚焦 - 超声波仪中超声处理约120微升输入DNA（如果从多个片段连接起来），在120μl水中超声处理90秒以产生400-450bp的片段峰值功率= 140 V，占空因数= 5，循环/突发= 200，平均功率= 7）。使用1 kb Plus DNA标准品（Invitrogen）在2％琼脂糖凝胶上使用溴化乙锭至少运行2-4μl（250-500 ng）DNA，以检查碎片DNA的峰值大小（图1A）。

图1.分子芯片方法中关键步骤的DNA凝胶实例 A.步骤6中的超声处理的DNA（2-4μl或250-500ng）在2％琼脂糖凝胶上显现，借助于250 ng 1 kb Plus DNA标准品，显示400-450 bp的峰片段大小。 B.在具有10bp DNA标准的4％LMP琼脂糖凝胶上观察到在步骤9中连接到衔接子的5μl（〜200ng）DNA片段，显示了更高分子量的衔接子二聚体和三聚体和连接的DNA片段的形成。 C.步骤9中的总连接装载到1％琼脂糖凝胶上，以显现并回收200-1,000bp线性DNA范围内的连接的DNA片段，如步骤10所详述。D.将适配器连接的DNA片段用 Eco P15I以释放38bp的DNA末端并加载到4％的LMP琼脂糖凝胶上以纯化38bp的DNA库，如步骤11中所详述的.E。全长sgRNA库用<将Hind III和Hind III载于4％LMP琼脂糖凝胶上以观察和纯化115bp的sgRNA DNA池，如步骤15所详述。注意，〜115-由于背景较高，bp DNA条带显得微弱
超声处理的片段在150μl末端修复反应中用15μlNEBnextEnd Repairing Enzyme Mix，30μlNEBNextEnd修复反应10x缓冲液修复，补充有蒸馏水至总共300μl，并在25℃下反应30分钟，然后用400-450bp的DNA片段进行1％的琼脂糖凝胶纯化（用1x-SYBR安全在蓝色凝胶底座如Maestrogen Illuminator凝胶中显现，以避免在UV光下DNA损伤，通过使用QIAEX II凝胶提取试剂盒，通常在实验室可以使用溴化乙锭来观察DNA）
为了从随机DNA片段的两端获得片段末端，首先通过退火两种寡核苷酸aaaactcgag cagcag tggatccG和/5phos/Cggatcca 来制备 ctgctg ctcgag（IDT）在1x连接缓冲液（NEB）中以10μM的比例加热至95℃，然后在PCR机中逐渐降温至1℃至25℃，通过在开水中逐渐冷却至室温。退火的DNA适配器含有EcoIp15I位点（粗体），然后是总共8-bp的间隔区，包括Bam HI位点（下划线）和G（大写）最终用于后续的sgRNA克隆作为U6启动子的转录起始位点
将〜12μg的DNA片段以〜1：10的摩尔比与6.0μg的上述退火的Eco-P15I-衔接子与20,000U T4 DNA连接酶（New England Biolabs）在300μl反应3 h，37°C。具有10-bp DNA标准（Invitrogen）的4％低熔点（LMP）凝胶上行5μl连接，以通过可视化形成44-bp适配器二聚体（我们也看到三聚体形成）并且存在较高MW DNA（图1B）
通过将其连接到具有NEB 100bp DNA梯的1％琼脂糖凝胶（图1C）上，并通过使用具有200-1,000bp线性标准范围的衔接物连接的DNA片段，从衔接子单体和其它非特异性条带纯化QIAEX II凝胶提取试剂盒1％凝胶对于最小化凝胶体积以增加产量为重要的。
将约5μg的EcoRⅠ连接的凝胶纯化的DNA用于100U的EcoRI P15I酶（New England Biolabs）在300μl与指定的缓冲液和ATP浓度在37°C正好1小时。为了检查步骤9中适配器连接的消化和效率的完整性，在4％低熔点琼脂糖凝胶上用溴化乙锭进行15μlDNA标准品（Invitrogen）的15μl消化，以显示38 bp（期望〜25 -50ng的38bp DNA片段;图1D）
消化后，通过等体积连续的苯酚/PCI /氯仿提取物清洗P15I消化反应，并在每次提取后以18,400×g离心5分钟，以除去潜在的与DNA结合的P15I蛋白反应提取时总是收集上层相。通过加入1/10体积的3M乙酸钠，pH 5.7和2体积的100％乙醇，用乙醇沉淀最终的上清液以沉淀DNA，以18,400×g离心10分钟并洗涤用70％乙醇的DNA沉淀，空气干燥，最后将DNA沉淀重新悬浮于50μl蒸馏水中。
沉淀的消化产物被凝胶纯化（在4％低熔点琼脂糖凝胶上），以获得约38bp的DNA片段（EcoRI/P15I-衔接子+来自随机末端的19/17碱基）DNA片段）通过用2倍体积的1×TAE缓冲液稀释凝胶切片，将加热块上70℃的凝胶切片溶解，用苯酚/PCI /氯仿萃取，并将DNA溶于20μl水中。
为了连接到其余的sgRNA主链，将280ng纯化的38-bp DNA库与40,000U（New England Biolabs，M0202T）T4 DNA连接酶在37℃下以50μl反应连接3小时，以1：5摩尔比至2.75微克的sgRNA-主链转接头。sgRNA-主链 - 衔接子含有两个Ns，用于结合来自EcoRI P15I消化产物的悬垂，剩余的sgRNA序列（无目标识别结构域），聚合酶III转录终止的polyT拉伸和 dIII克隆位点。通过使用QIAEX II凝胶提取试剂盒，通过退火两种寡核苷酸，随后进行4％低熔点琼脂糖凝胶纯化来制备该sgRNA-主链衔接子，以消除不合适的退火产物两个寡核苷酸：/5phos/nngttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-tttttttaagctttat
ataaagcttaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctctctaaac（IDT）。
有关退火两个寡核苷酸以准备sgRNA-主链转基因DNA的详细信息，请参见步骤8
连接的sgRNA DNA池通过QIAquick PCR Purification Kit进行清洗，在50μl中用20μL每个BamHⅠ和HindⅢ（New England Biolabs）消化，37℃过夜通过在4％低熔点琼脂糖（图1E）上运行10bp DNA标准品（Invitrogen）并通过使用MiniElute凝胶提取试剂盒获得〜115bp的sgRNA库来凝胶纯化。当运行大量连接的DNA量时，凝胶上的115-bp DNA带通常显得微弱，因为高凝胶背景
通过SYBR Safe Gel Stain（Invitrogen）在荧光计上定量该sgRNA库（总共〜10ng sgRNA库DNA，由步骤9中规定的原料产生），并以40:1的T4 DNA连接酶以3:1的摩尔比连接（ New England Biolabs），每100μl总DNA在室温下每10μl反应过夜进入含有U6启动子的逆转录病毒载体pSUPER-CRISPR的BamHⅠ-HindⅢ位点和嘌呤霉素选择标记（Cheng等人，2016b）。
连接的DNA是乙醇沉淀的（详见步骤4），并溶于10μl水中
使用GenePulser Xcell通过电穿孔将连接产物以30μl等分试样转化为NEB5α感受态细胞。然后将来自10次电转化的转化细胞合并在一起，在10ml LB培养基中培养1小时。进行几个小部分转化以估计总转化克隆。为了估计％克隆效率，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒将10-20个菌落生长至微量制备DNA，通过使用寡核苷酸ctccctttatccagccctca的Sanger测序证实克隆的sgRNA插入片段。我们发现约80％的克隆克隆了19-20个mer sgRNA。其他20％的克隆克隆了更短的sgRNA，这可能是由于EcoRI酶P15I的非特异性切割活性。
转化培养物在100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中生长过夜，用于质粒DNA制备。正确准备，一个> 100万克隆可以轻松实现。
对于逆转录病毒制备，功能性报告筛选的例子，sgRNA富集数据分析以鉴定功能性非编码基因组区域，以及机械研究的实例，参见我们以前的出版物（Cheng等人，2016b）。

数据分析

使用ApE程序中的DNA对齐特征分析Sanger DNA测序数据，可以在 http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/。要做到这一点，打开ApE中的两个序列，在程序中的"工具"下选择"对齐两个序列"，在新窗口的下拉菜单中指定两个序列文件，然后选择"确定"计算并生成新的对齐文件。 br />
sgRNA文库复杂度计算为总计E。大肠杆菌菌落数在平板时间稀释因子上

笔记

为了更好地了解sgRNA库的构建的不同阶段，请参阅我们以前的出版物（Cheng等人，2016b）中的整个技术过程的流程图以及Molecular chipper的一般概念流程图与传统的阵列合成的sgRNA文库生成相比，sgRNA文库产生（Cheng等人，2016a）。
指定的优化结扎和消化时间很重要。
从大量的输入DNA开始至关重要。我们从原始报告（Cheng等人，2016b）中以最少20μg的输入DNA开始，并且通常在任何中间步骤的情况下制备至少40-60μg的起始DNA材料在程序中
1：5摩尔比与衔接子的连接对于将DNA连接到DNA片段的两端是有效的连接。更多的适配器可能有助于提高连接效率，但会导致凝胶纯化的背景更高，因此难以使连接的DNA产物可视化。
获得数百纳克的38bp片段用于连接到sgRNA骨架是前进的必要条件。
通过转变足够的高素质能力的细胞来实现所需的复杂性/覆盖范围。我们比较了可用的商业细胞，发现NEB 5-αElectrocompetent E。大肠杆菌是最高的能力之一
如果在第一次生态P15I消化后不存在38bp的条带，则1）检查适配器是否退火良好：只连接适配器，这将导致存在单体的主要带， 4％低熔点凝胶上的次要非特异性条带; 2）检查超声处理的DNA是否被良好地修复，如果连接良好：在72℃下在dNTP存在下，通过Taq DNA聚合酶处理小部分修复的DNA 5分钟，随后进行TA克隆（Invitrogen）：如果终端修复工作良好，并且克隆插入片段的测序应显示克隆片段两端的衔接子，则应出现许多白色菌落; 3）通过在3-4％LMP凝胶上运行，通过连接的DNA凝胶纯化来减少背景物质的杂质。
如果在转化最终连接后没有足够的菌落/覆盖率，1）鉴定具有高转化效率的感受态细胞的商业来源，例如来自NEB的电穿孔感受态细胞; 2）或者，使您自己的电感细胞效率更高; 3）进行测试转化，计算整个菌落数/复杂度/覆盖率，然后再转换其余的连接以制作整个DNA文库。
如果克隆效率不高，1）用BamHⅠ和HindⅢ全长连接的sgRNA片段消化6小时，而不是过夜以使星形活性降至最低; 2）通过克隆一个模拟蛋白质HI-HindⅢ片段测试载体质量，如果需要，首先可以克隆填充物以有效制备双酶消化的载体。

食谱

50升TAE凝胶运行缓冲液每升
242克Tris碱
18.61g EDTA
57.1毫升冰醋酸
溶解于蒸馏水中，最终体积为1升

致谢

这项研究部分得到NIH授予R01CA149109（至J.L.）和R01GM099811（Y.D.和J.L.）的支持。该协议是从以前的工作（Cheng等人，2016a和2016b）进行了改编的。作者声明没有可能影响本协议的设计和实施的利益冲突或竞争利益。

参考

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