材料和试剂

玻璃单个磨砂显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：421-004T）
封面
定制的有机玻璃滑块与圆形开口在中心（将作为观察室的基础）
注意：开口直径应为1.25厘米。
双面胶带
金擦拭物
牙签
8孔室玻片（μ-slide）（ibidi，目录号：80826）
200μl和1,000μl移液管吸头
Sylgard硅胶板，用木炭染色（道康宁，目录号：3097358-1004）
1厘米硅片的微型针脚（精细科学工具，目录号：26002-10）
表达肌肉特异性荧光标记的苍蝇（例如，，mef2 -GAL4＆gt; UAS-CD8-GFP）
施耐德的媒介
胎牛血清（FBS）
BD Matrigel基质生长因子减少（Corning，目录号：354230）
卤碳油

设备

薄油漆刷
镊子（Dumont 55）（精细科学工具，目录号：11255-20）
Vannas弹簧剪刀，2.5毫米刀刃（精细科学工具，目录号：15001-08）
配有倒置显微镜和40x水浸物镜的共聚焦显微镜系统（例如，ZEISS，型号：LSM 780）
200μl和1,000μl移液器
125ml锥形瓶
25°C孵化器种植苍蝇（Elcon公司，定制）
有飞行食物的小瓶可以养殖和收集苍蝇
37℃用于基质胶凝固的培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heracell ^{TM 150i）}}
带有橡胶管的氧气罐
双目解剖显微镜（Nikon Instruments，型号：SMZ645）
荧光双目显微镜（Leica，型号：Leica MZ16F）

软件

禅黑软件（ZEISS）
Microsoft Excel
R统计软件（可从以下网址下载： https：//www.r-project。 org / ）

程序

用于实时成像的完整蛹的准备
注意：当在25°C生长时，IFM成肌细胞融合在18-22 h APF处于峰值，但该方法可用于在该时间范围之前或之后对IFM进行成像。 12小时APF或更早的蛹是更难以合作的，因为头端外翻尚未发生，所以瞳孔病例仍然附着在蛹上。
1. 选择表达荧光标记的IFM的飞行线。通过将白色蛹前（0-1小时）收集到新的小瓶中，并在25℃（例如）生长18-20小时，将蛹生长至期望的阶段。。可以通过它们形成的天线和缺乏任何色素沉着（白色）来鉴定蛹前。
2. 准备观察室，通过将打开的盖板粘贴到定制的有机玻璃滑动件上，使开口两侧的胶带（使盖玻片位于开口上方）（图1A）。
  
  图1.完整蛹。 A.用于成像完整蛹的定制幻灯片。盖子从开口两侧胶带。 B.傀儡在玻璃片上贴上双面胶带。对于解剖，首先用镊子（1）去除蛹壳的“盖子”。然后，将镊子的一侧放在蛹和蛹壳之间，向下和向外移动以撕开蛹壳（2）。将形成的“襟翼”提升到另一侧以暴露蛹（3）。 C.蛹壳从侧面剥下，打开到双面胶带，露出蛹。 D. GFP荧光过滤器视图，通过解剖显微镜和覆盖滑动，显示完整蛹的背侧，浸入卤碳油中。右下方放大盒装区域，显示6条IFM纤维。刻度棒=500μm（B和C），50μm（D）。
3. 在玻璃显微镜载玻片上，放置一条双面胶带。
4. 小心地，用小瓶的刷子提起分阶段的蛹，并将它们放在Kim-wipe上。仔细地揉搓金w擦去可能的食物残渣。
5. 使用刷子，将蛹背面朝上（平面朝下）放置在双面胶带上。用刷子轻轻按下蛹，以确保其粘附良好，而不会伤害蛹。
6. 接下来的几个步骤旨在打破蛹壳，并将完整的蛹移除/转移到观察室。在这些发展阶段，头部外翻应该是完整的，所以瞳孔与头部之间存在差距。用镊子仔细捕捉蛹壳的前端，向上抬起蛹壳的圆形“盖子”（图1B）。
7. 将镊子轻轻地插入您创建的前开口，使镊子的一个臂伸入蛹和蛹壳之间的空间。
8. 向外拉，撕开蛹壳。继续这个运动，直到瞳孔沿其背部方向一直打开到后端。
9. 现在可以通过镊子将瞳孔上部形成的“襟翼”抬起/打开，并将其附着在相对侧的胶带上，从而露出蛹（图1B和1C）。
10. 将封闭的镊子放在蛹下，轻轻提起并将其转移到附在定制滑块上的盖子上。蛹应坚持镊子。如果没有，请通过瞳孔的形成腿抬起腹部。
11. 使用镊子，定向蛹，使胸部（背侧）面向覆盖滑块。
12. 将卤代烃油放在单独的玻璃片上。从这一滴，使用牙签，拿起一小滴油，轻轻地转移到蛹上，使其大部分浸在油中。只能用足够的油来覆盖蛹，因为过量的油会导致长期成像期间蛹的运动。用金擦拭物吸收多余的油（图1C）。
13. 定向蛹，使其以约45°的角度稍微倾斜到一侧，以便为其中一个IFM获得更好的成像角度。
14. 使用倒置的共聚焦显微镜系统立即图像幻灯片。活体完整的蛹已成功成像长达12小时。请参阅下面的图像采集的更多细节。
离体和离散IFMs用于离体活体成像
1. 准备用Matrigel涂布的ibidiμ-滑片，如下。基质胶应在PBS中以1:10稀释，并在4℃下解冻过夜，如制造商所述 here 。使用微量移液管将100μl转移到单个孔中，并用尖端传播，以覆盖整个井的表面。重新吸取和去除整个100μlMatrigel。必须保留的少量将创造Matrigel大衣。为了制备多个孔，可以重复使用相同的100μl。丢弃剩余的液体。将ibidiμ-slide在37℃下放置30分钟，以使Matrigel硬化。

数据分析

一般来说，随着时间的推移可视化可以通过观察所获取的数据的时间延迟来提供对动态行为的洞察。使用Zen软件（ZEISS）创建单片的延时电影或数据的最大强度投影。例如，从表达Lifeact-GFP的切割的IFM的离体培养物到标记肌动蛋白纤维（视频1）的单个光学切片的延时电影显示出从它们的边缘发出的基于肌动蛋白的突起的成肌细胞，其显现为彼此纠缠在一起随着时间的推移，成肌细胞令人惊奇地不动。

Video 1. Ex-vivo IFM expressing mef2 > Lifeact-GFP. Movie shows a single slice of outer surface of isolated IFM, displaying the many myoblasts associated to the myotube.

具体特征的长度，频率，等等的量化也可以在该系统中执行。例如，Segal等人2016测量了表达膜标记Gap-GFP（Ritzenthaler等人，2000）的IFM中丝状伪足的长度。在这种情况下，随着时间的推移，动力学并不是必需的，因此获取了单个时间点的z-stack（图4）。使用Zen Black软件，选择z片的一个子集来包括肌管的丝状伪足，但不包括来自相邻肌管的背景。然后，进行切片子集的最大强度投影（MIP）。选择感兴趣的区域并进行裁剪（图4，红色框），并调整亮度以突出丝状伪足。将裁剪的原始数据转移到Zen Blue软件，以测量丝状伪足长度。将丝状伪足长度的输出转移到Excel进行分析。在R软件中进行实验组之间的丝状伪足长度差异的统计分析，但可以在任何统计软件上进行。

图4.如Segal等人，2016年的丝状伪足长度分析。详见文本。

笔记

背部肌肉（DLMs）和背上腹肌（DVM），两种类型的IFM仍然存在。 DLM可以被区分为两个肌肉组中较大者。以前的工作专门对DLM进行成像（Segal等人，2016）。
在开发过程中，DLM从三根纤维分裂成6根纤维，在16-18 h APF之间。因此，如果在此时间范围内解剖，IFM可能处于分裂中。
理想情况下，完整的DLM将包括3或6根纤维（见上文）和周围的成肌细胞。然而，单独的肌纤维在解剖过程中并不罕见。一般来说，成肌细胞仍然保留与剩余的肌纤维相关联，并且只要个体肌纤维保持完整，这些样品仍然可以成像。

致谢

这项工作是在以色列雷霍波特魏兹曼科学研究所的本尼·希洛教授和埃亚·谢赫特博士的指导下进行的。这项工作得到以色列科学基金会的资助。本协议的部分内容来自（Weitkunat和Schnorrer，2014）。该方案用于（Segal等人，2016）。

参考

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