材料和试剂

滤纸（GE Healthcare，目录号：1001-0155）
棉签（Fisher Scientific，目录号：23-400-119）
盖玻璃（厚度：0号）（Thomas Scientific，目录号：6661B40）
0.3ml胰岛素注射器（BD，目录号：328438）
培养皿
任何常见实验室菌株的成年小鼠，体重25〜35g
异氟烷（Patterson Veterinary Supply，目录号：07-806-3204）
制造商：Zoetis，目录号码：10015516。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P4417-50TAB）
琼脂糖3-A型（Sigma-Aldrich，目录号：A9793）
荧光素 - 葡聚糖（2 MDa;盐水中5％w / v）（Sigma-Aldrich，目录号：FD2000S）
玫瑰红（1.25％w / v盐水）（Sigma-Aldrich，目录号：330000-1G）
丁丙诺啡盐酸盐（Buprenex ®）（Patterson Veterinary Supply，目录号：07-891-9756）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653-1KG）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333-500G）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016-100G）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266-100G）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H7006）
人造脑脊髓液（ACSF）（见食谱）

设备

加热垫带反馈调节（FHC，目录号：40-90-2-07）
加热垫控制系统（FHC，目录号：40-90-8D）
直热电阻探头（FHC，目录号：40-90-5D-02）
异氟烷蒸发器（Datex-Ohmeda，型号：IsoTec4）
感应室（VetEquip，目录号：941444）
牙科钻（Osada，型号：EXL-M40）
双光子显微镜辅助设备（Sutter可移动目标系统[Taylor and Shih，2013]）

物镜4x，0.16 NA（Olympus，型号：UPLSAPO）
物镜20x，1.0 NA，水浸（Olympus，型号：XLUMPlanFI）
绿色激光532 nm（Beta电子，型号：MGM20）。关于如何将绿色激光线引导到Sutter MOM成像光束路径的细节在单独的协议中描述（Taylor和Shih，2013）

计算机规格（Imaris）

16 GB RAM
3.3 GHz CPU
AMD Radeon RX 480 4GB或更高版本
1280 x 1024分辨率监视器

软件

Imaris（Bitplane）

Imaris 7.6（或当前）
Imaris批量模块

斐济软件（ https://imagej.net/Fiji/Downloads ）< br />

程序

颅窗
为了进行毛细血管的光血栓闭塞，必须在小鼠头骨中产生颅骨成像窗口。可以使用两个变薄的颅骨窗（Drew等人，2010; Yang等人，2010），并且可以使用涉及完全去除颅骨的窗口（Holtmaat et al。，et al。。，2009）。也可以通过急性（<24小时）或慢性的窗口进行闭塞。该协议中所示的图像使用抛光和加固的薄型颅骨窗（PoRT），并且可以使用该窗口类型的视频和详细的书面程序（Shih等人，2012a和2012b）。
双光子显微镜和激光治疗血栓形成
我们的系统通过双光子成像光束路径将绿色激光束通过成像物镜（图1A和1B）。我们使用的显微镜是Sutter可移动物镜显微镜，以前介绍了如何引入绿色激光的细节（Taylor和Shih，2013）。绿色激光大大弥补了20x物镜（Olympus; XLUMPlanFI）的后孔，在成像平面上产生直径约20-40μm的固定激光对焦。绿色激光的功率在样品约为1 mW。在引发光血栓闭塞之前，应确定绿色激光焦点的位置。为了做到这一点，我们将一小片滤纸放在培养皿中，将25μl荧光素 - 葡聚糖涂于滤纸上，并用盖玻片盖住。使用20x物镜对滤纸进行成像，然后用绿色激光照射。绿色激光使荧光染料在其焦点处漂白，提供相对于成像场的目标位置（图2A和2B）。这也在以前的协议中深入描述（Taylor和Shih，2013）。我们用于检测荧光素 - 葡聚糖发射的过滤器组是525 / 70m-2P（Chroma Corp）。

图1.小鼠皮层毛细血管的光血栓闭塞。A.在典型的双光子成像显微镜中示意性说明双光子成像激光和B.光血红蛋白激光束路径。 C.目标使绿色激光成为皮层上层的焦点，允许毛细血管的光血栓形成照射。 D.包含在PoRTS窗口内的成像区域的宽场血管图，通过使用4x物镜收集的几个最大z投影图像进行蒙皮获得。 E.窗口内的放大区域，可视化为20x物镜（投影超过100μm的深度，从pial表面开始〜10μm），显示24小时内毛细血管的缺血性损伤。

图2.绿色激光聚焦目标光血栓形成。：一种。用绿色激光照射前的滤纸上的FITC-葡聚糖; B.用绿色激光照射后的滤纸的漂白区域显示激光焦点
靶向光血栓闭塞
1. 在双光子显微镜下麻醉鼠标并将动物的头部固定在稳定的成像装置上。对于麻醉，这里显示的数据是从C57BL / 6小鼠收集在0.75-1.5％在医用空气中供应的异氟醚。然而，也可以使用其他类型的麻醉。通常，在手术前的过程中，使用牙科粘固剂将定制的加工铝法兰连接到头部。后来，金属法兰可以使用螺丝固定到定制的支架上。头部固定的许多变体与本协议兼容。请参阅Shih等人（2012a）中针对小鼠头部固定的一种方法的方法。
2. 将25μl5％w / v荧光素 - 葡聚糖（2 MDa）管理到眶下静脉。使用0.3ml胰岛素注射器，将针尖小心地插入距离动物中线最近的眼角。为了确保针头不能太深地穿透，请使用黑色标记将尖端上的针标距3毫米。针头应该在眼后，稍微推动眼睛。在20秒内注射注射器的内容物。当正确给药时，没有任何溶液应积聚在眼睛外部。取出注射器，并用湿润的棉签仔细清洁眼睛。应将眼科软膏施用于双眼以避免干燥。此程序的视频也可用（Shih等人，2012b）。该程序应在麻醉下进行，并小心避免损伤眼睛。注射后立即用双光子成像清楚可见脉管系统。针头的深度插入将导致头颅内的荧光素 - 葡聚糖，并在双光子成像期间增加硬膜下荧光。
3. 从4倍目标的低放大倍数开始，通过颅窗可以通过整个皮质区获得脉管系统的z-叠层。这些图像在蒙皮时提供了用于在较高放大倍数下导航的皮质脉管系统图（图1D）。
4. 改变为20倍的目标，并将重点放在较大的船体表面。使用以较低放大倍率收集的地图来确定您在成像窗口内的位置。
5. 找到一个毛细血管区，没有较大的血管覆盖（图1E）。当找到感兴趣的毛细血管位置时，瞄准距离较大穿透血管至少20微米的区域，如果无意中闭塞可能会导致较大的中风。
6. 将绿色激光的目标放在待照射的毛细管床的区域（图1D和1E;白点）。
7. 使用上述荧光素 - 葡聚糖相同的方法将25-50μl的1.25％玫瑰红注入眶下静脉。
  重要事项：检查以确保在开始激光照射之前，视野和绿色激光对焦没有移动。
8. 通过打开绿色激光（图1B）（样品1 mW）并允许照射25秒，开始光血栓形成。
  重要事项：玫瑰红色染料只能在血液中保留约5-10分钟，在此期间迅速从血浆中清除。因此，在施用罗伯孟加拉之后尽可能快地进行照射是重要的。
成像毛细血管缺血的进展
在25秒照射后立即可以观察到在211×211×150微米立方体的组织内〜10个毛细血管段的血流完全停止（图3A;黄色箭头）。毛细管段被定义为分支点之间的毛细管长度。毛细管壁的完整性通常保持在第一个0.5-1小时，此后染色剂渗漏的局部位点从非流动毛细管开始出现（图3A;白色箭头）。这些泄漏点的数量在3小时内逐渐增加。对于每个成像时间点，我们收集照射区域的图像z-叠层。虽然我们的研究表明在闭塞后3小时内发生的变化（Underly等人，2017），但是精确的实验时间线和成像间隔可以基于实验问题进行调整。

图3. 体内毛细管渗漏的观察和事后定量。 A.体内跟踪皮质毛细血管的光凝照射3小时后的毛细血管渗漏; B.辐射前毛细管的二维（左）和三维（右）表示。六维ROI（紫色）沿着三维面板中的毛细管段串联，ROI 8位于泄漏的中心点。 C.照射后1小时显示相同的血管，当荧光素 - 葡聚糖渗漏明显时。 D.荧光素 - 葡聚糖体积前（虚线）和后（实线）照射的图，对应于毛细管渗漏部位。面板C数据的后照射染料体积迹线显示为实线红线。
图像处理
Imaris支持多种成像格式，但斐济软件可用于将与Imaris不兼容的格式转换为.tif文件。确保x-y和z平面的像素/微米比正确输入到Imaris中。可以在Imaris软件中的图像属性中修改这些比率。同样重要的是考虑您的文件名，因为Imaris将组合类似的文件名不会分成不同的文件夹。
1. 首先通过利用斐济的二维.tif栈识别染料泄漏的初始区域。这些是血管内染料开始扩张超出血管初始（前图像）边界的区域，并且与高强度荧光区域相关联（图3A;白色箭头）。
2. 使用Imaris打开包含荧光素通道的图像堆，在染料泄漏开始之前或之后捕获。
3. 在Imaris中以3维呈现的图像，沿着发生泄漏的脉管系统的感兴趣的字符串区域（ROI）（图3B和3C;紫色右列）。

数据分析

随着ROI（体积）渲染（Surface创建中的最后一步），可以生成卷的图形表示。这可以通过绘制每个ROI内的染料泄漏体积（在Imaris的“统计”选项卡中找到）来完成。通过沿着毛细管串联几个ROI，可以通过在毛细血管闭塞之前和之后的图像的ROI之间显示体积的显着变化来区分泄漏显着增加的区域（图3D）。通过执行比较每个相应的ROI（ROI 1 pre与ROI 1 post，等等）之间的差异，可以找到这种差异。如果实验过程中使用的组数或次数符合方差分析的标准，则可能需要ANOVA而不是 t 测试。

笔记

关于毛细血管闭塞和染料渗漏，根据取样时间，染料体积的变化很大。重要的是在时间点（每15分钟或更长时间）拍摄频率足以捕获事件的形成。

食谱

荧光素 - 葡聚糖
5％（w / v）无菌PBS
预先加入0.3ml胰岛素注射器等分试样储存于-20°C
玫瑰孟加拉
1.25％溶液（w / v）在无菌PBS中预先加入0.3ml胰岛素注射器等分试样储存于-20°C
人造脑脊髓液（ACSF）
125 mM NaCl
5 mM KCl
10 mM葡萄糖
3.1mM CaCl 2
1.3mM MgCl 2
10 mM HEPES（pH 7.4）
维持在4°C

致谢

我们的工作得到了A.Y.S.的资助。来自NINDS（NS085402，NS096997），国家科学基金会（1539034），达纳基金会，美国心脏协会（14GRNT20480366），阿尔茨海默氏症协会NIRG奖，南卡罗来纳临床和转化研究所（UL1TR000062），查尔斯顿阿尔茨海默病新视力会议颁奖典礼，颁奖典礼，以及授权号码为P20GM12345的NIGMS颁发的机构发展奖（IDeA）。

参考

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