材料和试剂

培养皿
1.5毫升无RNase的一次性颗粒杵和1.5毫升管（Fisher Scientific，目录号：12-141-368）
一次性剃刀刀片
8条井格式管（Denville Scientific）
硬/硬塑料解剖平台/板
塑料包装
滤纸（703 Style Whatman）
带盖的96孔板（Corning，目录号：3370）
手套和适当的个人防护装备
15 ml离心管
快速冷冻的老鼠肝脏
去离子水
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（Fisher Scientific，目录号：BP24384）
液氮
冰
干冰
5x被动裂解缓冲液（Promega，目录号：E1941）
BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：23227）}
L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）
吡哆醛5'-磷酸盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：P9255）
乙酸铅（II）三水合物（Sigma-Aldrich，目录号：316512）
琼脂糖（HS分子生物学级）（Denville Scientific，目录号：CA3510-8，或使用相似的）
注意：本产品已停产。
1x被动裂解缓冲液（见配方）
20mM醋酸铅（II）三水合物（参见食谱）
H 2 S反应混合物（参见食谱）
1％琼脂糖凝胶，100mM醋酸铅（II）三水合物（参见食谱）

设备

将液氮烧瓶（Thermo flask 2122）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：2122）}
镊子
比例（OHAUS，目录号：EP214C）
移液器和提示（单次使用和多通道移液2μl至5 ml）
-80°C冰箱
电动磨碎机（Fisher Scientific，目录号：12-1413-61）
37°C水浴
微型离心机（VWR，型号：Galaxy 16DH）
UV-Vis读卡器（BioTek Instruments，型号：Synergy 2）
大玻璃Pyrex烤盘（> 100毫升）
玻璃烧瓶（> 100 ml容量）
真空烘箱（VWR，目录号：89508-424）
孵化器（VWR，型号：1500E）
数码相机（柯达，型号：柯达EASYSHARE C182）
涡旋混合器（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）
电脑（惠普Pavilion dv6和联想IdeaPad）
热块立方体（9.5 x 7.5 x 5厘米）或其他重物，大小尺寸为

软件

GraphPad Prism 7
Microsoft Excel
ImageJ
Gen5

程序

注意：该协议包括通过终点测定（方法B）或动力学测定（方法C）测量H 2 S生产能力的两种相关技术。两种技术都使用特定的化学方法，其中乙酸铅（白色）在暴露于H 2 S时被转化成硫化铅（棕色至黑色）。这些技术的检测方法不同，（方法B）利用端点密度测定来定量滤纸上的硫化铅点，而（程序C）利用310nm波长的光的动能吸收以及终点光密度测定琼脂凝胶上的硫化铅斑点。首先介绍共享的常见过程和技术（过程A），然后再分为两个区别的细节。

共享程序
1. 组织样品
  1. 根据您的机构动物福利委员会批准的动物使用方案详述的程序，在安乐死后消除小鼠肝脏组织。
    1. 在安乐死和收获之前，在冰上的陪替氏培养皿中制备10ml PBS，以用作清除从切除的肝组织中的表面血液/碎片的洗涤液。另外，用液氮填充液氮烧瓶
    2. 安乐死后，迅速取出肝左大叶，在PBS中冲洗，放入1.5ml离心管中，并在液氮中快速冷冻。
    3. 将样品放在液氮中，直到所有肝脏都被收获
  2. 对于以前收获的肝脏样品，储存在-80°C直到准备好均匀化
2. 使老鼠肝脏匀浆
  1. 用1.5ml离心管中的肝脏样品，从液氮或-80°C冰箱中取出，放在干冰上。
  2. 使用无菌或干净的一次性剃刀和镊子，快速从管中取出冷冻的肝脏，切下放在干冰上的硬塑料或其他解剖平台/片材上的片段，并将其称重至约100mg。
    注意：这种重量不需要准确，只需足够接近，以便样本之间的肝脏样本与体积的裂解缓冲液的重量相对恒定。
  3. 在仍然冷冻的同时，将约100毫克的肝组织置于新的1.5毫升离心管中，预冷在干冰上。
  4. 从5x被动裂解缓冲液（Promega）与去离子H 2 O组成一个新鲜的1x溶液的被动溶解缓冲液（参见食谱）。
    注意：1x被动裂解缓冲液应保存在常规冰上，并通过每次测定进行新鲜处理。 5x被动裂解缓冲液在不使用时应始终保存在-20°C。不幸的是，食谱是专有的。
  5. 一次一个1.5 ml管，每个近似100 mg样品中加入250μl1x被动裂解缓冲液。
  6. 立即用带有Pellet Pestle（Fisherbrand）的电动组织研磨机（Fisherbrand）开始均质，直到样品完全均匀。这通常需要30秒至1分钟才能执行。
  7. 从管中取出研磨机和研杵，固定盖子，并将均匀的样品和1.5 ml试管放入液氮中闪光冷冻。
  8. 继续均匀化所有样品，将其保存在液氮中
  9. 一旦所有样品均匀化，同时从液氮中除去所有样品，并在室温下解冻约5-10分钟，或在37℃水浴中约1-5分钟。
    注意：注意使用适合冷冻/解冻的液体N 2的管子，以避免样品损失和爆炸管的潜在伤害。
  10. 重复冻融另外两次，确保在液体N 2中至少1分钟的冷冻，并保持与上述相同的解冻时间。
  11. 将微量离心机的管子在4℃下以5,000×g的速度旋转5分钟。
  12. 取出并将上清液（〜200μl）保存在8条样品管形式中，如果立即进入下一步骤（蛋白质浓度测定），置于冰上。如果没有，则将管冷冻并置于-80°C冷冻箱中，直到准备进行蛋白质浓度测定。
3. 蛋白质浓度测定和蛋白质浓度正常化
  1. 在新鲜的8管井管中，放置198μl去离子水和2μl肝匀浆上清液，进行1:100稀释。
  2. 按照Pierce BCA蛋白测定试剂盒的指示，准备用于蛋白质浓度测定的试剂盒中所含的工作溶液和标准BSA溶液（0μg/μl至2μg/μl）。
  3. 在每个需要的孔中移取200μl测定溶液，5μl标准品或1：100稀释样品。
  4. 盖上塑料包装，并在室温下在黑暗中孵育30分钟。
  5. 打开平板并将其放在UV-Vis分光光度计上。
    注意：我们使用运行Gen5软件的Synergy 2多模板阅读器，但可以使用其他读卡器。
  6. 测量562 nm光线的吸光度
  7. 根据从每个标准562 nm处的吸光度获得的标准曲线方程，确定每个样品的蛋白质浓度。
  8. 在新的8条试管中，使用1x被动裂解缓冲液将每个样品的蛋白质浓度归一化至20μg/μl。将最终体积提高至100μl。
    注意：如果不能使用20μg/μl，则将每个样品稀释至10μg/μl或其他合适浓度。
过滤纸 - 醋酸铅终点测定
1. 准备醋酸铅滤纸
  1. 在大型玻璃Pyrex盘中，将100毫升20毫克醋酸铅（II）三水合物（见食谱）倒入去离子H 2 O中。
  2. 将703样式Whatman滤纸切成96孔板（8 x 12.5厘米）的大小尺寸尺寸。
  3. 将切割的滤纸放入乙酸铅（II）三水合物溶液中，并浸泡至少20分钟
  4. 通过将湿纸放入设置在110℃的真空炉中并将真空开启，将乙酸铅（II）三水合物嵌入并干燥到滤纸中。让这些纸放在真空烘箱中20-30分钟。
  5. 将成品纸在室温下储存在黑暗和干燥的区域，直至准备使用。虽然我们没有经验性地测试这些文件的保质期和稳定性，但它们在生产至少一个月后是有利的。
2. 制备H 2 S生产能力反应溶液。
  注意：对于每个测定，这必须是新鲜的。
  1. 计算运行所有样品所需的体积。每个样品需要150μl反应溶液（参见食谱）
  2. 制备L-半胱氨酸（PBS中100mM）和吡哆醛5'-磷酸（PLP）（10mM在PBS中）的工作原料。半胱氨酸每次必须新鲜。对于PLP，升温至37℃，涡旋可能是完全溶解粉末所必需的。 PLP储存液可以在-20°C等分几个月储存。
  3. 在足量的PBS中以覆盖所需体积的反应混合物，加入L-半胱氨酸至终浓度为10mM，并且将吡哆醛5'-磷酸水合物加至最终约1mM浓度。
  4. 保持室温并立即使用。
3. 设置测定
琼脂包埋乙酸铅动力学测定从肝脏提取物和数据分析确定H 2 S生产能力
通过使用Nafion聚合物嵌入的银离子微孔板用于H 2 S生产（Jarosz等人， >，2013）。该测定提供动力学分析的潜力，使得更容易确认获得的数据处于线性范围并低于饱和点。与过滤纸方法相比的缺点包括增加设置时间和减少可以一次运行的样品数量。该方法如下所述：
1. 准备醋酸铅琼脂板
  1. 通过微波将玻璃Pyrex烧瓶中的250毫升1％琼脂糖凝胶（来自Denville的琼脂糖HS分子级）（参见食谱）在双去离子H 2 O 2中，直到所有琼脂糖溶解。 />
  2. 让它稍微凉一些，但不要让它开始凝固。
  3. 将乙酸铅（II）三水合物加入到琼脂糖中至终浓度为100mM。将手混合，直到所有的乙酸铅（II）三水合物溶解。
    注意：在正常条件下，醋酸铅在室温下或室温下不溶于水。然而，当把它放入热/温热的琼脂时，应该小心佩戴面罩。此外，应根据各研究机构的规定，妥善处理含铅化合物进入适当的化学废物容器。
  4. 将1％琼脂糖/ 100mM醋酸铅溶液倒入96孔培养板的顶盖上
  5. 让溶液在平坦的表面上在黑暗中固化和冷却30分钟。
    注意：加入顶盖的琼脂糖/乙酸铅溶液的体积约为50ml。然而，由于96孔格式板和顶部的形状和样式的差异，可能需要调节该体积以覆盖盖的内部的整个表面并具有足够的体积，使得边缘接触凝胶，使得它们在凝胶中留下轻微的印象，而不会破坏凝胶。
2. 凝胶凝固后，将其置于黑色未被覆盖的同时制备H 2 S 2 S生产能力的反应溶液和板。应立即使用并长期不保存，以防止凝胶的干燥/破裂。
3. 建立H 2 N 2 S生产测定反应

数据分析

在终点测定中获得的数据的分析和解释如下：

将反应与含醋酸铅的滤纸或琼脂凝胶反应到形成可检测但不饱和的硫化铅环的位置。
使用数码相机或其他成像设备（如数字图像扫描仪或凝胶/印迹成像仪）取出滤纸或琼脂凝胶和图像。
然后可以通过使用IntDen（集成密度）作为读数的ImageJ，通过每个圆的光密度分析图像文件。确保还要分析滤纸或琼脂凝胶的一部分相同尺寸的区域，在那里没有样品可用于背景扣除。
当与添加的蛋白质的标准，对照或已知量相比时，结果将产生相对的H 2 S 2 S生产能力。建议以技术重复或一式三份运行所有个别样品，并对每种条件至少进行三次生物复制。
结果可以相对于对照组或标准表示为平均H 2 N 2 S生产能力，或者可以绘制为从ImageJ分析减去背景读数给出的平均原始任意IntDen单位。 >

在动力学测定中获得的数据的分析和解释如下：

在UV-Vis分光光度计上取310 nm读数的基线吸光度。
将板在37℃下孵育0-120分钟。在0-120分钟之间的各个时间点，取盘，并在平板阅读器上分析310nm处的吸光度。
在该测定的动力学/时间段部分获得的定量和数值数据通过从0μg蛋白反应减去310nm处的背景吸光度并绘制实验样品的310nm处的吸光度数据来完成。这可以作为x轴上时间的函数或作为x轴上蛋白质浓度的函数完成。
当与在各种时间点加入的标准，对照或已知量的蛋白质相比时，结果将产生相对的H 2 S 2 S生产能力。建议以技术重复或一式三份运行所有个别样品，并对每种条件至少进行三次生物复制。
结果可以作为每个实验条件的310nm平均吸光度，作为特定时间的函数或使用曲线下所有时间点的面积计算。

通过所有这三个测试，当比较两组之间时，可以使用Student's -test的标准统计分析，或者当比较来自多个实验组的值时，可以使用具有适当多重比较检验的方差分析。

笔记

尽管我们在这个方案中专注于哺乳动物肝脏，但大多数材料，试剂，设备和程序都适用于其他组织类型和生物体。蛋白质浓度，样品体积，L-半胱氨酸浓度，吡哆醛5'-磷酸盐水合物浓度和孵育时间可能需要根据使用的组织类型和/或生物体进行调整。我们已经观察到较弱的H 2 S生产组织和生物体需要更长的孵育时间（高达8小时甚至过夜），加载的蛋白质量（高达1mg），L-半胱氨酸浓度增加高达100mM），和/或增加的吡哆醛5'-磷酸盐水合物浓度（高达10mM），以便实现合适和可量化的硫化铅信号。此外，肌肉和结缔组织需要比肝脏更强的均匀形式，例如使用珠子/子弹匀浆或机械刀匀浆。否则，在本方案中采取的大多数步骤对于产生高和弱H 2 N 2 S的哺乳动物组织是相同的。然而，来自非哺乳动物，无脊椎动物和酵母的组织/样品可能需要额外的和/或替代的步骤来获得最佳结果。例如，被动裂解缓冲液中的蠕虫（电解质）的均质化需要通过超声波器或珠子/子弹均质化所需的机械力，与肝匀浆所需要的和不溶性/角质层的使用相比较蠕虫匀浆物的一部分可用于H 2 S检测。最近的出版物显示了成功的C。使用醋酸铅对硫化铅滤纸方法的线虫生产能力测定可以在这里找到：（Wei和Kenyon，2016）。对于果蝇，可以将全匀浆（包括可溶和不溶部分）用于H 2 S测定，并且可以通过加入相同数量的苍蝇进行归一化（20至25是合适的数目）进入反应。对于酵母，醋酸铅纸可以简单地放置在培养瓶顶部的塑料/软木/橡胶塞的下侧，以捕获由活酵母培养物产生的H 2 S。 />
列出的大部分材料，试剂和设备均具有特定的品牌和目录号。这并不意味着被视为该品牌和/或产品的具体认可。其中许多可以替代研究者认为适合使用的其他品牌和/或目录号码，或与研究人员实验室中当前存在的材料。此外，随着时间的推移，某些供应商的某些目录号可能会更改，或者产品可能无法从该供应商处获得，因此可能需要进行替换。虽然我们已经使用专有的被动裂解缓冲液（Promega）取得了成功，但也可以使用其他已知组合物的非离子裂解缓冲液。每次使用时，应将醋酸铅放在远离光源和液体溶液的新鲜处。应佩戴手套和适当的个人防护装备，例如安全眼镜和实验室外套，以防止与铅接触并在处理细胞和组织时暴露于潜在的生物危害。铅和细胞和组织生物危害的适当处置应遵循相应的直觉方法。
选择组织均质和裂解的方法是由于其易于使用和保持蛋白质处于天然状态的能力，并保持产生H 2 S的酶的酶活性。然而，也可以使用其他方法，例如使用珠粒搅拌器或转子定子，并且可以更适合于硬组织如肌肉和结缔组织的均匀化。
为了防止蛋白质降解和变性并保持适当的酶功能，应尽快在安乐死后立即从小鼠收获肝脏，并且所有均匀化步骤和导致酶法测定的步骤均应进行蛋白质匀浆/裂解物在冰上或保持冷（约4℃至10℃）。
理想的孵育时间总是近似值，并且取决于蛋白质的添加量以及蛋白质的来源，并且应该在该组中最强生产样品的硫化铅点的饱和点之前停止。
每个反应中加入的蛋白质的量为μg，由研究者决定，只要蛋白质是限制因子，而不是底物或辅因子。添加的蛋白质越多，测定法将越快运行。然而，如果添加太多的蛋白质，则可能导致底物（L-半胱氨酸）或辅因子（吡哆醛5'-磷酸盐水合物）成为限制因素，从而损害测定并给出假结果。在我们手中，添加到反应中的100μg蛋白质裂解物往往给出可靠的结果
L-半胱氨酸是优选的底物或“燃料”（Singh等人，2009）和吡哆醛5'-磷酸盐水合物（PLP）的辅因子（Zhu et al。 em>，2008）用于CGL依赖性产生H 2 S。每个测定应使PBS中的L-半胱氨酸工作原料新鲜。在PBS中的10mM PLP的工作储备可以提前准备，等分，并在-20℃下保存至少几个月。
通过CGL和CBS可以原理上添加用于监测H 2 S 2 S生产能力的多个用于H 2 S 2代的潜在底物。虽然L-Cys是用于CGL依赖性H 2 S生产的优选底物，但L-Cys与L-高半胱氨酸的CBS依赖性H 2 S 2 S生产缩合为50x比单独的L-Cys更有效（Chen et al。，2004）。酶抑制剂可以进一步用于区分H 2 S酶的酶源。例如，可以在加入底物之前加入3mM炔丙基甘氨酸，特别是CGL的自杀抑制剂，以确定CGL对H 2 S代的特异性贡献（Kabil等al。，2011）。
即使胱硫醚β合酶和胱硫醚γ裂解酶用于其酶活性和H 2 S生成的通用辅因子称为维生素B6，应当注意，对于这些离体只能使用生物活性形式的维生素B6（吡哆醛5'-磷酸酯，又称PLP），而不是维生素B6（吡哆醇）的更常见形式的体外）
两种定量方法（基于图像的浓度定量法与基于琼脂的醋酸铅方法与动力学吸光度的基于滤纸的终点测定）之间的比较显示在终点测定中具有高蛋白浓度的饱和度，但不是在动力学测定中给定的时间框架。这可能是由于三维琼脂覆盖物中的H 2 S和乙酸铅与二维滤纸之间的相互作用增加的表面。另外，用于通过读板器/吸光度法（分光光度计和Gen5分析软件）定量的光学工具比简单地分析平面数字图像的密度更复杂。因此，在较高的蛋白质输入水平下，可以从平板阅读器/吸光度方法中提取比图像/密度法更多的信息。然而，至少记录和分析凝胶上产生的硫化铅的图像档案目的似乎是有用的。
滤纸方法（图1）的检测灵敏度/极限是蛋白质浓度和孵育/曝光时间的函数。理论上，如果培养时间延长（约4至24小时），即使少量来自肝脏或其他强H 2 S 2 S生成组织的蛋白质应当产生可检测的信号。然而，如本文所述使用短的孵育/暴露时间，我们发现甚至50微克的蛋白质在滤纸方法中给出足够的信号。理论上，基于动力学琼脂的方法理论上具有比滤纸方法更高的灵敏度，这里我们能够在60,90和120分钟的时间内从37.5微克的蛋白质中检测到H 2 S的产生分。

食谱

1x被动裂解缓冲液
8ml去离子H 2 O
2 ml 5x被动裂解缓冲液（Promega）（-20°C储存）
在每次测定中补充新鲜物质，并在其使用期间保持冰上
丢弃未使用的1x被动裂解缓冲液
20 mM醋酸铅（II）三水合物
100ml去离子H 2 O
759mg乙酸铅（II）三水合物（Sigma-Aldrich）
每个批量生产的醋酸铅滤纸可以在室温下新鲜化妆
H 2 S反应混合物（10mM L-半胱氨酸，1mM吡哆醛5'-磷酸盐水合物，在PBS中）
10 ml磷酸盐缓冲盐水（又名PBS），不含钙，无镁，pH 7.4（Fisher Scientific）
11.9mM磷酸盐
137毫克氯化钠 2.7 mM氯化钾
12.1mg L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich）
2.5mg吡哆醛5'-磷酸盐水合物（Sigma-Aldrich）
使用涡旋混合器
将所有试剂混合在15 ml离心管中注意：

不是所有的吡哆醛5'-磷酸盐水合物（PLP）都将溶解。混合1-2分钟后，在离心机中短暂旋转以沉淀未溶解的PLP，并保存上清液使用。
对于每个测定，这必须是新鲜的。一旦制造，立即使用，不要放在冰上

1％琼脂糖凝胶，100mM醋酸铅（II）三水合物

50ml双去离子H 2 O
500 mg HS分子生物学级琼脂糖（Denville）
在大烧瓶和微波炉中混合，直至所有琼脂溶解让它稍微凉一些，但不要让它开始固化
加入1.9g醋酸铅（II）三水合物（Sigma-Aldrich）至琼脂糖
将手混合，直到所有的乙酸铅（II）三水合物溶解。确保在琼脂糖固化之前快速进行
将1％琼脂糖/ 100mM乙酸铅溶液倒入96孔培养板的顶盖上，使其在黑色中冷却并固化在平坦的表面上
注意：在运行化验之前，必须做好新鲜事。