材料和试剂

注意：“材料和试剂”一节中提到的所有项目都可以从任何合格的公司订购。

移液器提示
组织培养板（58 x 15 mm）（Thermo Fisher Scientific）
超级冰霜+幻灯片（Thermo Fisher Scientific）
TC烧瓶T25（SARSTEDT）
70μm孔径网（BD Falcon）
40μm孔径网（BD Falcon）
96孔平底板（NUNC）
96孔圆底板（NUNC）
Eppendorf管安全锁
不锈钢珠，5毫米（QIAGEN）
组织加工/嵌入盒（Sigma-Aldrich）
手镯（Swann Morton）
流量珠（Beckman Coulter）
Vero细胞
L929细胞
小鼠株：C57BL / 6小鼠
注意：
1. 不同小鼠品种的遗传背景可以影响研究，已经观察到不同的小鼠品系C57BL / 6，BALB / c，SJL / J，PL / J和A / J对HSV具有不同的敏感性。 C57BL / 6和BALB / c小鼠对HSV中度敏感，而A / J，PL / J和SJL / J小鼠株高度敏感（Lopez，1975; Kastrukoff等，2012）。还观察到，对于生殖器HSV-2感染，129Sv背景小鼠与C57BL / 6相比产生更高量的I型和III型IFN，然而在HSV-2感染后阴道中没有观察到病毒滴度的差异（ Ank，2008）。
2. 阴道HSV-2感染模型基于用depo-provera预处理。孕激素的预处理是一种人为干预，但对于C57BL / 6小鼠中对HSV-2感染的再现性增强的敏感性是必需的。
病毒株：HSV-2 333株（实验室分离株，Stanberry等人，1982）
水泡性口炎病毒（VSV / V10）（印第安那菌株）（ATCC，目录号：VR-158）
磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）（Sigma-Aldrich）
Depo-Provera（辉瑞）
异氟烷（Piramal Critical Care）
DMEM（不含抗生素或FSC）（Lonza）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific）
胎牛血清（FCS）（体外技术）
0.2％人免疫球蛋白（ZLB Behring）
0.03％亚甲基蓝（Sigma-Aldrich）
2％甲醛（Sigma-Aldrich）
乙醇（Sigma-Aldrich）
二甲苯（Sigma-Aldrich）
甲醇（Sigma-Aldrich）
0.5％过氧化氢（H 2 O 2 O 2）（Sigma-Aldrich）
10 mM Tris
0.5mM EGTA（pH9.0）
50mM NH 4 Cl
多克隆兔抗HSV-2（Agilent Technologies，Dako，目录号：GA521）（1:100）
HRP共轭二抗（Agilent Technologies，Dako，目录号：P044801-2）（1:200）
3,3'-二氨基联苯胺（Kem-En-Tec）
Mayer's或Harris's苏木精溶液（Sigma-Aldrich）
Eukitt试剂（Eukitt，O.Kindler）
胶原酶/分散素（1 mg / ml）（Roche Diagnostics）
DNase 1（2 mg / ml）（Roche Diagnostics）
乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）（0.02％）
抗小鼠CD16 / CD32 Ab（eBioscience）
IgG，1μg/ ml（Jackson ImmunoResearch）
抗小鼠抗体（BD Pharmingen）：
1. CD45-APC（克隆30-F11）
2. NK1.1-FITC（克隆PK136）
3. Nk1.1-PE（克隆PK136）
4. CD11b-PE（克隆M1 / 70）
5. Ly-6g-APC（克隆1A8）
6. APC RAT IgG2b，κ同种型
7. FITC RAT IgG2a，κ同种型
8. PE RAT IgG2a，κ同种型
9. 7-AAD（活/死细胞标记）
TRIzol（Invitrogen）
DEPC水
氯仿（Sigma-Aldrich）
异丙醇
Invitrogen Ambion DNA免费试剂盒
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich）
0.05％皂角蛋白（Thermo Fisher Scientific）
0.2％明胶（Thermo Fisher Scientific）
0.3％Triton X-100（Thermo Fisher Scientific）
ELISA试剂盒（R＆amp; D Systems）
无RNA酶水（Roche Diagnostics）
Oligo（dT）（Roche Diagnostics）
展开逆转录酶（Roche Diagnostics）
缓冲液A（参见食谱）
缓冲液B（参见食谱）
缓冲区C（见配方）
FACS缓冲区（见配方）

设备

移液器
8臂多功能一体机
切片机（Leica）
微波炉
摇摆平台
湿度室
Motar /杵
离心机
紫外线灯
光学显微镜
均质器/振动筛
孵化器
qPCR选择平台
NanoDrop
流式细胞仪

程序

阴道感染
1. 通过皮下注射Depo-Provera的200μl（2mg /小鼠，在PBS中稀释的PBS）预处理小鼠。
2. 五天后，用异氟烷麻醉小鼠，并用悬浮在PBS中的20μlHSV-2（6.7×10 4 /μl）PFU阴道内用移液管仔细接种，见图1.重要的是不破坏或在接种过程中损伤阴道上皮层，因为这可能会干扰自然感染
  
  图1.用移液管阴道内接种病毒
3. 随后，将小鼠放置在背部并在麻醉下保持10分钟。
4. 可以在感染后的所需时间点通过将体积为40μl的PBS吸入和移出阴道12-15次来收集阴道洗液/液体，重复两次，并且还在PBS中稀释至最终体积为250μl。对于阴道收获，通过颈椎脱位（c.d.）对小鼠进行安乐死，通过手术取出阴道，用于RNA提取，流式分析或免疫组织化学。
5. 每天应观察和检查感染原殖的动物，并评分阴道炎症，神经系统疾病，体重减轻和死亡。使用以下标准评估疾病的严重程度：0，健康; 1，生殖器红斑; 2，中度生殖器炎症; 3，脓性生殖器损伤/一般条件差; 4，后肢麻痹或一般情况非常差。小鼠必须由c.d.牺牲根据制度指导达到4级。
收集用于测量病毒滴度和细胞因子产生的阴道清洗液
1. 在感染后的期望天，通过将2×40μlPBS吸入和移出阴道来洗涤小鼠的阴道，然后将其进一步在PBS中稀释至每只小鼠250μl的最终体积。注意不要损伤阴道上皮层。
2. 在洗涤过程中，用异氟烷麻醉小鼠。阴道洗液中的病毒滴度和细胞因子浓度通常在感染后第2天最高。
3. 洗完后，可以将小鼠处死，以收集整个阴道组织进行其他分析，或继续进行生存或疾病评分记录。
病毒斑块测定
1. 在干冰上立即将阴道洗涤，并储存在-80°C直到分析。
2. 在Vero细胞的单层上测定阴道洗液的病毒滴度。将细胞接种在补充有5％FCS的DMEM中，密度为1.2×10 6细胞/组织培养板（58×15mm），并放置过夜以沉降。
3. 第二天丢弃培养基，并向每个组织培养板中加入400μl具有5％FCS的新鲜DMEM。随后，每个培养板中加入100μl阴道洗液，稀释于10％连续稀释于含有2％FCS的DMEM中，因此每个培养板中的总体积为500μl。每个培养皿代表阴道洗涤液的一种稀释液。重复每次稀释。
4. 孵育细胞1小时，每15分钟摇一下板，以确保病毒的均匀分布。 1小时后，加入5ml补充有0.2％人免疫球蛋白的DMEM 5％FCS。
5. 然后将组织培养板进一步温育2-3天，用0.03％亚甲蓝染色，以计数斑块。
免疫组织化学（IHC）
注意：与冷冻切片相比，石蜡是优选的，以保持形态。我们不使用灌注固定，因为阴道的血液循环似乎很低。将阴道通过浸入2％甲醛的PBS中24小时而手术取出并固定。如果没有其他的话，在室温下工作。
1. 将阴道切开并置于PBS中的2-4％甲醛中并固定24h
2. 将固定的组织放置在组织处理/嵌入盒中
3. 固定组织脱水：70％乙醇2小时，96％乙醇2小时，99％2小时。
4. 然后将脱水组织置于二甲苯中2小时。
5. 将组织嵌入温热（60℃）石蜡中2小时。
6. 从切片机上的组织块切割两千米的部分，并将部分安装在超级霜+幻灯片上。
7. 载玻片在二甲苯中脱蜡4-5分钟。
8. 切片在一系列乙醇中再水化：3×99％乙醇（总共30分钟），2×96％乙醇（共20分钟），最后在70％乙醇中10分钟。然后将切片在MilliQ水中漂洗3-4次。
9. 使用具有0.5％过氧化氢（H 2 O 2 O 2 2）的绝对甲醇将内源性过氧化物酶阻断10-15分钟。
10. 将切片在10mM Tris，0.5mM EGTA（pH 9.0）的微波炉中煮沸以显示抗原。沸腾时间取决于微波炉〜6分钟。全功率，然后10分钟半功率。这将提供软间隔沸腾。
11. 使用摇摆平台在冰上冷却。
12. 游离醛基被PBS中50mM NH 4 Cl封闭30分钟。
13. 然后将切片在缓冲液A中洗涤3次（3×10分钟）（参见食谱）并与在缓冲液B中稀释的HSV-2的一抗（参见食谱）一起在4℃在湿度室中过夜。
14. 第二天，把这些部分从冰箱里拿出来，允许达到室温。
15. 用缓冲液C（参见食谱）（3×10分钟）洗涤，并将缓冲液B中HRP-缀合的二抗（P448,1:200）的切片孵育1小时。
16. 冲洗缓冲液C 3 x（共30分钟）。
17. 通过在0.03％H 2 O 2 O 2中使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）（Kem-En-Tec）显现抗体结合。 DAB通过将1片溶解在10ml MilliQ水中并刚好在使用之前新添加10μl35％H 2 O 2 O 2。
18. 在PBS中冲洗3 x
19. 切片用Mayer's或Harris's苏木精溶液复染2分钟，并在自来水冲洗20分钟。
20. 这些部分使用Eukitt试剂安装。
流式细胞仪
1. 小鼠阴道的单细胞悬液可以通过酶和机械加工获得。将解剖的阴道通过解剖刀切成小块，并转移到小型培养瓶（T25）中。加入4ml胶原酶/分散酶（储备：1mg / ml）和2ml DNase I（储备：2mg / ml），总共6ml，并在37℃恒温搅拌下孵育45分钟。
2. 然后使用杵杵将组织悬浮液轻轻捣碎，并通过70μm孔径筛网过滤，然后通过40μm孔径的网孔（如果感兴趣的细胞小于40μm），并用0.02％EDTA的PBS洗涤至停止酶活性。
3. 然后将细胞以300×g离心8分钟并重新悬浮于200μlPBS /阴道中。可以在圆底96孔板中进行以下染色。
4. 在染色之前，用抗小鼠CD16 / CD32Ab（1:100）和小鼠和大鼠IgG（1μg/ ml）在冰上封闭细胞10分钟。
5. 用冷PBS洗涤，并在4℃下以300×g离心板4分钟。
6. LiveDead（7-AAD）染色（PBS中1：1,000）。在冰上孵育15分钟。
7. 用PBS洗两次。
8. 将细胞与100μl的一抗在黑暗中冰上孵育30分钟，并在FACS缓冲液中洗涤（参见Recipies）。
9. 以下主要抗小鼠抗体可用于细胞群体的流动鉴定：CD45-APC（克隆30-F11），NK1.1-FITC（克隆PK136），Nk1.1-PE（克隆PK136），CD11b-PE （克隆M1 / 70），Ly-6g-APC（克隆1A8），APC RAT IgG2b，κ同种型，FITC RAT IgG2a，κ同种型和PE RAT IgG2a，κ同种型和7-AAD（活/死细胞标记）。流量计数珠可以在分析前用于确定细胞计数的流量样本。
10. 将细胞重新悬浮并固定在PBS中的250μl1％甲醛中。
检测阴道清洗中的细胞因子
注意：为了确定阴道洗液中细胞因子的量，我们使用ELISA和Luminex技术，并检测IFN-α/β，我们使用了基于L929细胞的生物测定法。细胞因子CXCL10，CXCL9，CCL5（Rantes），IL-6，IFN-λ和IFN-γ可以通过任何供应商的ELISA试剂盒轻松检测。 IFN-α/β生物活性可以通过在96孔板中使用基于L929细胞的生物测定来测量。
1. 在阴道样品中使用HSV-2之前，必须通过紫外线治疗6小时将其在冰上灭活。
2. 在平底96孔板中的每个孔中加入50μlDMEM 5％FCS。每个板可以容纳8个不同的样品/对照（A2-H2），因为样品在板上稀释。第1列（A1-H1）作为细胞对照，列12（A12-H12）作为病毒对照。
3. 向行2（A2-H2）中的每个孔中加入50μl阴道洗涤液或鼠IFN-α/β。使用8臂多面体连续两次稀释至第11排（A11-H11）。
4. 在每个孔中加入补充有5％FCS的DMEM中的L929细胞（2×10 4个细胞/100μl中的孔），并将板在37℃下孵育过夜。 L929细胞在补充有200IU / ml青霉素，200μg/ ml链霉素和5％FCS的DMEM中生长。
5. 第二天将50μl水泡性口炎病毒（VSV / V10）（1.6×10 4 /μl）/ PFU / ml加入每个孔，并将板再孵育2-3天。
6. 如果在测试样品中存在IFN-α/β，IFN-α/β将保护细胞免受VSV的细胞毒作用，如在明场显微镜中观察到的。介导50％保护免受病毒诱导的细胞死亡的稀释液定义为1U IFN-α/β/ ml。生物测定具有较低的检测限，为6U / ml
来自组织的RNA提取和定量实时PCR
根据制造商的建议，用TRIzol提取来自分离的阴道的总RNA。
1. 将离心机用于Eppendorf管的转子在2-3°C。
2. 向每个样品/阴道添加100-150μlDEPC水和一个5mm钢珠，并使用匀浆器/振荡器匀浆组织。使用安全锁Eppendorf管。如果需要，重复。
3. 均化后立即将样品置于冰上
4. 向每个样品中加入500μlTRIzol并涡旋。（根据Invitrogen，使用1ml TRIzol至50-100mg组织）。在室温下孵育5分钟。
5. 加入1：5氯仿（100μl，500μlTRIzol），涡旋直到混合物为“糖果”。在室温下孵育5分钟，或直到检测到两个相
6. 在4℃下以10,000×g离心15分钟。
7. 将上清液吸入新的Eppendorf管。避免管子侧面的白色蛋白质膜。
8. 加入异丙醇（1：1）。漩涡
9. 将试管置于-20℃2小时或室温10分钟
10. 在4℃下以10,000×g离心12分钟。
11. 丢弃上清液。 RNA沉淀物在管的底部形成白色凝胶状颗粒。
12. 加入0.5ml冰冷乙醇（80％）并短暂涡旋。以10,000 x g离心4分钟。重复洗涤步骤。
13. 丢弃上清液。接下来，将颗粒空气干燥。如果需要，在80°C下使用加热块。
  注意：可能难以溶解RNA颗粒。
14. 将颗粒重新悬浮于20-50μlDEPC-水中。涡流。
15. 无DNA酶处理：（Invitrogen Ambion DNA免费试剂盒）

食谱

DMEM补充200 IU / ml青霉素，200μg/ ml链霉素和FCS
补充有2％FCS和0.2％人免疫球蛋白的DMEM
缓冲区A
PBS含1％BSA，0.05％皂角蛋白，0.2％明胶
缓冲区B
含有0.1％BSA和0.3％Triton X-100的PBS
缓冲区C
含有0.1％BSA，0.2％明胶和0.05％皂苷的PBS
FACS缓冲区
PBS中的2％BSA（如果需要，为0.09％叠氮化合物）

致谢

我们感谢K.S. Petersen和I.M.Pulsen提供技术援助和AU FACS核心设施的技术帮助。由丹麦医学研究理事会（12-124330至SRP; 1331-xg00133B至HHW），诺和诺德基金会（SRP），隆德贝克基金会（R34-3855至SRP），奥胡斯大学研究基金会（SRP），健康科学，澳大利亚（MBI），丹麦国家研究基金会（DNRF107至HHW），跨学科研究优秀计划（CDO2016至HHW）。

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