材料和试剂

Kimwipe（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34155）
25 x 75 mm显微镜载玻片（Globe Scientific，目录号：1301）
22 x 22毫米厚度盖玻片（Globe Scientific，目录号：1401-10）
24 x 50毫米1号盖玻片（Genesee Scientific，目录号：29-118）
Pyrex 9孔玻璃斑点板（Fisher Scientific，目录号：13-748B）
制造商：Corning，PYREX ^{® ，目录号：7220-85。}
琥珀色玻璃滴管瓶（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM ，目录号：02-983B）}
Bel-Art ^{TM SP Scienceware ^{TM 广口色码安全标签洗瓶（Fisher Scientific，目录号：22-288654）
制造商：SP Scienceware - Bel-Art产品 - H-B仪器，目录号：F11646-3739。}}
Bel-Art ^{TM SP科学触发式喷雾器，带53 mm适配器（Fisher Scientific，目录号：01-189-100）
制造商：SP Scienceware - Bel-Art产品 - H-B仪器，目录号：F11620-0050。}
聚丙烯小瓶（Genesee Scientific，目录号：32-120）
Droso-Plugs，窄瓶（Genesee Scientific，目录号：59-200）
果蝇股票：

ChETA：y ^{1 w *; wg ^{Sp-1 / CyO，P {Wee-P.ph0} ^{BaccWee-P20 ; p {20XUAS-CHETA.YFP} attP2 / TM6C，Sb ^{1 （布卢明顿果蝇库存中心，目录号：36495） />}}}}
CaMPARI：w *; p {UAS-CaMPARI} attP40（Bloomington ia果蝇库存中心，目录号：58761）
GCaMP6（中型）： w ^{1118 ; PBac {20XUAS-IVS-GCaMP6m} VK00005（布卢明顿果蝇库存中心，目录号：42750）}
III类md神经元驱动程序：GAL4 ^{19-12 和 GAL4 ^{nompC （布卢明顿果蝇 Stock Center，目录号：36369和36361）（Turner等人，2016）}}
IV类md神经元驱动程序：GAL4 ^{pp1。 9 和 GAL4 ^{（Turner等，2016）}}
控制菌株： w ^{（Bloomington 果蝇库存中心，目录号：3605）}

所有反式视黄醛（ATR）（Sigma-Aldrich，目录号：R2500）
Halocarbon Oil＃700（LabScientific，目录号：FLY-7000）
无水乙醚（Fisher Scientific，目录号：E138-500）
NutriSoy，大豆面粉（Genesee Scientific，目录号：62-115）
黄色玉米粉（Genesee Scientific，目录号：62-101）
琼脂II型（Genesee Scientific，目录号：66-104）
非活性干酵母（Genesee Scientific，目录号：62-107）
干糖蜜（Genesee Scientific，目录号：62-119）
O-磷酸（Fisher Scientific，目录号：A242-212）
丙酸（Fisher Scientific，目录号：A258-500）
果蝇媒体（见食谱）

设备

冷板测定
1. 刷（Craft Smart ^{®圆刷设置金色Taklon）（Michaels商店，型号：Size 3，目录号：10408282）}
2. 尼康身体加镜头组合（尼康，型号：D5300）和AF-S Nikkor 18-55毫米DX VRII（尼康，型号：AF-S DX）
3. 用于安装DSLR的三脚架
4. 冷板冷却器（TE Technology，型号：CP-031）
5. 冷板温控器（TE Technology，型号：TC-720）
6. 冷板电源（TE Technology，型号：PS-12-8.4A）
7. 红外线温度计（Fluke，型号：Fluke 62 MAX）
8. 铝板 - 层压铝垫片（全球设备，目录号：WBB512969）
  注意：
  1. 将垫片以0.22mm厚度切割成7.5×11.5mm。
9. 黑色喷漆-12盎司黑色通用喷漆（Rust-Oleum）
在体内GCaMP测定
1. PE120珀耳帖级（Linkam Scientific Instruments，Linkam Scientific，型号：PE120）
2. 来自（Linkam Scientific Instruments，Linkam Scientific，型号：T95）的T95系统控制器（包括T95连接板和PE95）
3. 能够成像GFP的激光共焦显微镜（Carl Zeiss，型号：LSM 780）
光学剂量反应测定
1. D5300数码单反相机（尼康，型号：D5300）
2. 用于将尼康DSLR安装到蔡司显微镜上的适配器：Nikon F的T2适配器（Carl Zeiss，型号：T2适配器，目录号：416009-0000-000）和适配器60N-T2 1.0x（Carl Zeiss，型号：Adapter 60N，目录号：426103-0000-000）
3. 玻璃板：10 x 15 x 0.1 cm
CaMPARI Ca ^{2 + 积分仪测定光转换滤镜立方体 612/69 BrightLine带通滤波器，25 mm（IDEX Health＆amp; Science，Semrock，目录号：FF01-612 / 69-25）

440 nm BrightLine SWP边缘滤波器，25 mm（IDEX Health＆amp; Science，Semrock，目录号：FF01-440 / SP-25）

562 BrightLine二向色分光镜，25.2 x 35.6 mm（IDEX Health＆amp; Science，Semrock，目录号：FF562-Di03-25x36）

Axio Zoom.V16（ZEISS，型号：Axio Zoom.V16），带照明器HXP200c灯（Carl Zeiss，型号：HXP 200C）

轻触式刺激：镀镍针架（精细科学工具，目录号：26018-17），带有单个精细油漆刷毛刷

有害的冷刺激：TE技术冷板冷藏机在冷板测定中描述}
果蝇媒体准备
1. Adventurer Pro II分析/精密天平（Ohaus，型号：AX2202）
2. FastPette V2移液器控制器（Labnet International，目录号：P2000）
3. 10ml血清学针（Genesee Scientific，目录号：12-104）
4. Droso-Filler，Narrow（Genesee Scientific，目录号：59-168）
5. Avantco感应范围（Avantco设备，型号：IC3500）
6. 不锈钢锅盖（雷霆集团，目录号：SLSPS020）
7. 窄航空小瓶重装纸盘（Genesee Scientific，目录号：59-207）

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）
视频到视频转换器（ http://www.videotovideo.org/ ）< br />
Zeiss Zen Blue Lite（ https ：//www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen-lite.html ）

程序

冷板分析
注意：以下步骤描述了有毒的冷刺激如何传播到黑腹果蝇幼虫的腹侧表面。将幼虫放置在黑色金属板上，以实现幼虫的高对比度成像，允许恢复运动，然后通过将黑色金属板放置在冷冻的珀尔帖板上而暴露于有害的热刺激。使用此测定法评估有害的冷诱发行为反应的好处是该测定将动物的整个腹侧表面暴露于有害的冷刺激，并且可以定量评估该行为（参见数据分析部分）。
1. 冷板测定
通过GCaMP进行体内钙成像
注意：我们设计了一个实验范例，用于使用现代共聚焦成像和荧光技术在活的完整的黑腹果蝇幼虫中成像瞬时钙反应。通过对位于半透明角质层正下方的幼虫md感觉神经元的研究来促进这些新的体内分析。我们使用幼虫md神经元类特异性GAL4驱动器来指导GCaMP6的表达，即瞬时荧光细胞内Ca 2 + 传感器。为了评估活体GCaMP对有害感冒暴露的反应，我们通过Linkam Peltier系统传递刺激。使用这种方法可以评估活体动物制剂中任何PNS神经元中的GCaMP钙反应
1. 在建立钙成像的遗传交叉或股票之前准备。
  1. 准备一个含有卤代烃油＃700的琥珀色玻璃滴管瓶。这将用于体内成像的显微镜载片准备。
    注意：水也可以工作，但是＃700的卤代烃油具有更大的粘度，这对于安装不能移动的22×22mm盖玻片是理想的。
  2. 优化激光共焦显微镜延时成像设置。
    注意：
2. 在钙成像之前，如上所述设置冷板测定的基因交叉或库存，并将小瓶置于29℃。
3. 将食物小瓶中的年龄胚胎收集至96-102小时AEL并选择第三龄期幼虫进行成像。
4. 设置水循环系统，Linkam PE 120珀耳帖级，将Peltier级安装到激光共聚焦显微镜上，打开共聚焦显微镜（图2A和2B）。
  注意：
  1. 使用双面胶带将帕尔帖舞台安装到显微镜平台上。
  2. 允许激光器的时间稳定和最大限度的水循环。
    
    图2. 体内 GCaMP设置，温度曲线和III类md神经元GCaMP响应。水循环箱（1），温度编程器（2），温度控制器（3）和蔡司激光共聚焦（4）。激光共焦显微镜阶段（1）与珀尔帖阶段（2）的关系; C.关闭如何将幼虫安装在与珀尔帖阶段连接的珀尔帖阶段（1）和水循环管道（2） D. GCaMP测定的样品温度曲线; E. III类md神经元GCaMP对有害感冒的反应。荧光强度表示为查找表。与基线（25°C）相比，响应于有害的冷温度（6°C），GCaMP荧光增加很大。
5. 使用T95连接板编程预定温度曲线。
  理想地，在25℃下2-5分钟基线，以20℃/ min（最大斜坡速度）下降至所需温度，保持所需温度至少10秒，然后以20℃/ min升高至25℃并保持1分钟（图2D）。
  注意：对于多次有害的热刺激，允许在25°C下至少1分钟使GCaMP信号返回基线。
6. 准备显微镜幻灯片进行钙成像
  1. 获得一个显微镜载玻片，两个22 x 22毫米盖玻片和一个24 x 50毫米长的盖玻片。
  2. 在幻灯片的两端放上一滴卤碳油＃700。
  3. 将两个小盖玻片放在小滴的顶部。一次一片地盖上盖玻片，盖玻片难以移动后停止。
  4. 使用刷子轻轻拿起一只幼虫，将GCaMP表达为您想要的细胞类型，并在9孔玻璃斑点板中洗涤幼虫。将幼虫置于湿的Kimwipe上。
  5. 将半湿的幼虫放在幻灯片的中间。
    注意：根据激光共焦显微镜的设置，与幻灯片的长度相比，幼虫的方向与水平或垂直方向不同。
  6. 在小盖玻片的顶部放一滴水。如果幼虫在幻灯片上不直，请使用镊子轻轻地将幼虫重新调整到首选方向。
  7. 在幼虫的顶部和两个盖玻片上放置一个24 x 50毫米的盖玻片。再次，这一次轻轻地摇摆，直到幼虫完全平坦，直到动物面向上方的想要的一面（图2C）。
7. 将含有幼虫的幻灯片放在Linkam PE 120 Peltier舞台上。
8. 专注于感兴趣的区域，并获得热循环持续时间的延时图像。
  在基线（25°C）和有害的低温（6°C）下，III类md神经元的代表性GCaMP反应（图2E）。
多模态感官处理的功能测定
最近的研究已经揭示III型md神经元在多模式感觉加工中的功能（Turner等人，2016）。 III类神经元作为有害的感冒伤害感受器，其中冷引起双侧头部和尾部收缩（CT）以及无害的机械传感器，其中轻微的触觉主要仅唤起头部退缩（HW）反应（Tsubouchi等人， / em>，2012; Yan等人，2013; Turner等人，2016）。
我们开发了一种光遗传剂量反应测定，并实施了稳定的钙积分器CaMPARI的使用，以研究单一类md感觉神经元如何能够针对两种不同的感觉刺激来介导独特的行为（HW和CT）。在光遗传剂量反应测定中，我们滴定激活III级md感觉神经元的蓝光强度的量，显示在高蓝光强度下，CT是主要行为，而在较低的蓝光强度下，HW是主要行为，如最低的蓝色强度，我们没有观察到任何CT行为和只有几个HW响应者（Turner等人，2016）。光学剂量反应显示III级激活水平决定行为输出，并表明III类神经元是高阈值冷伤害感受器和低阈值机械传感器。
为了功能评估III级活化的不同程度如何导致不同的感觉行为，我们检查了细胞内钙对温和触感和有害冷刺激的反应。在完整的幼虫中，通过轻触摸评估细胞内钙动力学，在体内GCaMP测定中提出了技术挑战。
因此，我们实施了使用类别特异性表达的CaMPARI，其中幼虫自由行为，并且可以传递无害的机械或有害的冷刺激。这种技术允许我们测量绿 - 红荧光光转换的量，显示有害的冷引起比无害机械刺激显着更大的光转化。这两种技术都可用于评估PNS神经元的多态性
光学剂量反应测定
1. 优化光传送和记录系统。
  1. 使用Zeiss AxioZoom.V16显微镜可以改变交付给动物的光强度。
    1. 在保持放大倍数和白光源恒定的同时，将光圈从100-37％改变（图3A）注意：首选光圈设置为100％，90％，80％，70％，50％40％和37％。
    2. 使用显微镜舞台上的暗场照明设置。打开LED进行底部照明，增加亮度，足够勉强看到幼虫。
  2. 将记录设备安装在显微镜上。
2. 准备如上所述的遗传交叉或股票，并在发光剂量反应测定之前将胚胎收集至96-102小时AEL。
3. 准备ATR补充食物进行光遗传实验
  1. ATR的最终浓度需要为1,000μM
  2. 在昏暗的房间里，在液化食品中加入适量的ATR，彻底混合，使食物凝固。
    注意：在黑暗中维持ATR和ATR补充的食物。
4. 对于ATR条件：将基因交叉/库存添加到ATR补充食物的小瓶中。
5. 对于无ATR控制条件：将基因交叉/库存添加到正常的含有食物的小瓶中。
6. 将两种类型的十字架放在黑暗中。
7. 实验当天。
CaMPARI Ca ^{2 + 积分仪测定与GCaMP分析一样，优化红色和绿色荧光的活体共焦成像
优化光转换（PC）光强度，实现一致的绿光转换。 PC灯通过Zeiss AxioZoom.V16使用之前描述的过滤器立方体集。

使用Zeiss AxioZoom.V16显微镜和HXP200C灯，提供84,000勒克斯的20秒的PC灯，在高钙的情况下，可靠的将CaMPARI从绿色转换为红色。

在成像前至少一天，在琥珀色玻璃滴管瓶中准备1：5（v / v）乙醚：卤代烃油＃700溶液比例。

准备如上所述的遗传交叉或股票，并在CaMPARI分析之前将胚胎收集至96-102小时AEL。

准备显微镜幻灯片进行钙成像。获得一个显微镜载玻片，两个22 x 22毫米盖玻片和一个24 x 50毫米长的盖玻片。

在玻片两端放置一滴乙醚：卤代烃油＃700溶液。

将两个小盖玻片放在小滴的顶部。盖上盖玻片，一次一张，盖玻片难以移动后停下来。

打开您的电脑发光系统。

在显微镜的基础上设置刺激输送设备。对于有害的冷刺激，放置如图4A所示的珀耳帖板。

对于轻触式刺激，请将细毛刷刷到镀镍针座上，如图4A所示

图4.显微镜幻灯片准备。A.蔡司AxioZoom.V16的视图，佩尔贴板放置在显微镜平台上，幼虫可以通过冷和递送的PC光刺激。 1. TE技术冷板，2.黑色金属板，3. TE技术。电源，4. TE技术。温度控制器，5. PC灯，6.HXP200C白光源，7.蔡司AxioZoom.V16显微镜和8.插图显示精细刷毛的图像，安装到镀镍针座上。 B.对于活的共聚焦成像，将幼体安装在显微镜载玻片上，背面朝上并完全拉伸。 C.表达CaMPARI的III类神经元的代表性图像。 PC（光转换灯）和NS（无刺激）。

使用刷子轻轻拿起一只幼虫，将其表达为所需细胞类型的CaMPARI，并在9孔玻璃斑片中洗涤幼虫。将幼虫置于湿的Kimwipe上。

将幼虫置于蔡司AxioZoom.V16下。同时提供刺激和20秒的PC灯。对于冷刺激：将一只幼虫置于黑色金属板上。轻轻将金属板放在珀尔帖板上（设定为6°C），然后打开PC灯。

对于轻触摸刺激：在黑色金属板上放置一只幼虫。将轻触摸刺激首先提供给幼虫的头部，然后沿着动物的长度进行中风，同时将动物暴露于PC灯。

将幼虫安装在显微镜载玻片上（图4B）。将幼虫放在幻灯片的中间。
注意：根据激光共聚焦显微镜的设置，幼虫的方向与幻灯片的长度不同，水平或垂直方向不同。

在两个小盖玻片上放一滴乙醚：＃7卤代烃油溶液。如果幼虫在幻灯片上不直，则使用镊子将幼虫重新定向到首选方向。大量添加乙醚滴液：卤代烃油＃700溶液到幼虫周围。

在幼虫的顶部和两个盖玻片上放置一个24 x 50毫米的盖玻片。再次，这一次轻轻地摇摆，直到幼虫完全平坦，直到动物面向上的一侧。

神经元类型感兴趣的神经元细胞体的z-stack图像。
成像多个片段和/或两个半数将允许更详细地分析空间CaMPARI响应。}

数据分析

冷板和光遗传剂量反应测定的行为定量

使用视频到视频转换器解压缩视频文件（ videotovideo.org ）。
在ImageJ中打开未压缩的视频文件作为灰度级。
使用阈值功能使幼虫成为黑色和白色（图5）。
使用ImageJ函数使用以下设置删除离群值：radius = 2.0像素，阈值= 50，以及哪些异常值：选择暗。
应用以下功能：使二进制和骨架化。观看整个视频，以确保幼虫骨骼没有异常的分支或突起（图5）。
使用分析功能，测量区域，这将给出视频持续时间的幼虫长度。
执行从最大长度计算的百分比变化：％最大长度=（L> max -L _{n ）/ L max L _{max 是幼虫的最大长度。}
L 是一帧中的幼虫长度。

图5.用于定量行为分析的ImageJ截图}

使用ImageJ / Fiji进行的体内钙成像数据分析

在x，y或z轴上丢弃具有过度移动的视频。
将延时数据文件上传到ImageJ上。
运行ImageJ插件用于横向运动稳定的StackReg 注意：刚体和平移是影像稳定期间使用的两种最佳选择。
在细胞体周围绘制感兴趣的区域，并使用称为Plot z轴轮廓的ImageJ函数，测量每帧的标准化面积的平均荧光强度。
使用2秒移动平均值平滑原始数据。
使用以下等式计算ΔF/ F _{0 =（F -F 0）/ F 0 x 100}

F _{0 是基线期间的平均荧光}
F是一帧的荧光

使用Zeiss Zen Blue Lite进行的CaMPARI Ca ^{2+ 积分仪测定数据分析（图4C）}

在神经细胞体的最大强度投影周围绘制感兴趣区域。
量化红色和绿色荧光。
计算荧光变化，如先前在Fosque等人（2015）中所述。
CaMPARI photo-conversion = F _{red / F _green}

食谱

果蝇媒体

成分：
18.4克大豆油 132克玉米粉
12克果蝇琼脂
36 g无活性干酵母
194克干糖蜜
2.15升水
9毫升丙酸
1.56ml O-磷酸注意：制作约2升的果蝇介质，足够200瓶。
将以下成分混合在一个大型烹饪容器中：大豆，果糖琼脂，玉米粉，无活性干酵母，干糖蜜和水
在中等至高温烹饪，直到食物沸腾。每5-10分钟彻底混合一下
让飞行食物低沸腾30分钟，然后关掉炉子
等到烹饪容器温热接触并加入适量的酸（O-磷酸和丙酸）
彻底混合，将飞行食物倒入Droso-Filler，以制作飞行食物小瓶
在小瓶装载的托盘中倾倒所需的体积

致谢

我们感谢Kevin Armengol在Turner等人描述的GCaMP测定和定量行为分析中的冷板测定的初始设计。（2016）。 Cox实验室由NINDS R01 NS086082，NIMH R15 MH086928，Brains＆amp;行为种子授予奖和2CI神经元学和分子基础疾病奖（GSU）到D.N.C. A.A.P.由2CI神经元学研究员（GSU）资助。

参考

Fosque，BF，Sun，Y.，Dana，H.，Yang，CT，Ohyama，T.，Tadross，MR，Patel，R.，Zlatic，M.，Kim，DS，Ahrens，MB，Jayaraman， Looger，LL和Schreiter，ER（2015）。神经电路。使用设计的钙积分器在体内标记活性神经回路。科学 347（6223）：755-760。
Gorczyca，DA，Younger，S.，Meltzer，S.，Kim，SE，Cheng，L.，Song，W.，Lee，HY，Jan，LY and Jan，YN（2014）。＆lt; a class = ke-insertfile“href =”http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25456135“target =”_ blank“> Ppk26的识别，Ppk1以相互依赖的方式起作用的DEG / ENaC信道指导中的运动行为 Cell Rep 9（4）：1446-1458。
Guo，Y.，Wang，Y.，Wang，Q. and Wang，Z.（2014）。＆nbsp; PPK26在果蝇中的作用幼虫机械伤害感受。 Cell Rep 9（4）：1183-1190。

Im，SH和Galko，MJ（2012）。＆nbsp; Pokes ，晒伤和热辣酱：果蝇作为伤害感受生物学的一个新兴模式。 Dev Dyn 241（1）：16-26。 >

Mauthner，SE，Hwang，RY，Lewis，AH，Xiao，Q.，Tsubouchi，A.，Wang，Y.，Honjo，K.，Pate Skene，JH，Grandl，J。和Tracey Jr.，WD（2014）。巴尔博亚（PPK-26）绑定到体内的Pickpocket ，并且是在果蝇幼虫中进行机械伤害感应所需的。 24卷（24）：2920-2925。

Tsubouchi，A.，Caldwell，JC和Tracey，WD（2012）。树枝状丝状伪足，Ripped Pocket，NOMPC和NMDARs有助于果蝇的幼体感。 Curr Biol 22（22）：2124 -2134。

Turner，HN，Armengol，K.，Patel，AA，Himmel，NJ，Sullivan，L.，Iyer，SC，Bhattacharya，S.，Iyer，EP，Landry，C.，Galko，MJ和Cox，DN（2016）。 TRP频道Pkd2，NompC和Trpm行为冷感知神经元，以介导果蝇中有害感冒的独特的厌恶行为。 26（23）：3116-3128。

Yan，Z.，Zhang，W.，He，Y.，Gorczyca，D.，Xiang，Y.，Cheng，LE，Meltzer，S.，Jan，LY and Jan，YN（2013）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23222543”target =“_ blank”> 果蝇 NOMPC是一种机械转导通道亚基，触摸感觉。自然 493（7431）：221-225。