材料和试剂

移液器提示
10厘米板
1.5 ml Eppendorf管
透析器（EMD Millipore，目录号：71507-3）
pGEX-KG-GST-YAP质粒（Addgene，目录号：33052）
BL21（DE3）感受态细胞（Agilent Technologies，目录号：230134）
HEK293A细胞
LB肉汤（Fisher Scientific，目录号：BP1426-2）
羧苄青霉素二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：205805-250MG）
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：I5502）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010049）}
蛋白酶抑制剂混合片（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626-5G）
二硫苏糖醇（DTT）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610611）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
谷胱甘肽琼脂糖4B（GE Healthcare，目录号：17075601）
Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11965092）}
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10437028）}
磷酸酶抑制剂迷你片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：88667）}
蛋白A / G磁珠（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：88802）}
激酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：B6022S）
冷ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A2383）
山梨醇（Fisher Scientific，目录号：S459-500）
抗体
1. Lats1抗体（Cell Signaling Technology，目录号：3477S）
2. pYAP S127抗体（Cell Signaling Technology，目录号：4911S）
3. pLATS-HM抗体（Cell Signaling Technology，目录号：8654S）
4. GAPDH抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-25778）
5. GST抗体（Sigma-Aldrich，目录号：SAB4200237）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3294）
Tris-base（Fisher Scientific，目录号：BP152-10）
L-谷胱甘肽还原（Sigma-Aldrich，目录号：G4251）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-10）
甘油（Fisher Scientific，目录号：G33-1）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：S529-500）
溴酚蓝（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610404）
氟化钠（NaF）（Acros Organics，目录号：424325000）
EDTA（Mediatech，目录号：46-034-CI）
NP-40替代品（Sigma-Aldrich，目录号：74385）
洗脱缓冲液（见配方）
透析缓冲液（见配方）
4x SDS样品缓冲液（参见食谱）
轻度溶解缓冲液（参见食谱）
TBS缓冲（见配方）

设备

移液器
分光光度计（Biochrom，型号：Biochrom WPA Biowave II）
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，型号：Sorvall ^{TM RC 6 Plus）}}
声波除垢器（Sonicator）（Fisher Scientific，型号：505型）
台式离心机（Denville Scientific，型号：Denville 300D，目录号：C0265-24）
磁性架（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
Shaker（Eppendorf，New Brunswick ^{TM ，型号：Excella ^{® E24）}}
热块

程序

纯化GST-YAP蛋白
1. 通过在42℃热休克45秒，在BL21（DE3）感受态细胞中转化pGEX-KG-GST-YAP。
2. 用100μg/ ml羧苄青霉素在LB琼脂平板上培养细胞，并在37℃下孵育过夜。
3. 挑取单个菌落，并接种于含有羧苄青霉素的5ml LB肉汤中。在37°C孵育过夜。
4. 将5ml培养的细菌倒入500ml LB肉汤中，并在37℃下生长2-3小时，直到OD 600 = 0.6-0.8。
5. 诱导0.1-0.4 mM IPTG。在16°C过夜振荡。
6. 在4℃下将细菌以4,000 x g 旋转15分钟。
7. 将细胞溶解在9ml PBS + 1x蛋白酶抑制剂+ 1mM PMSF + 1mM DTT中
8. 在冰上超声处理总超声处理时间1分30秒，间隔15秒。 Amp = 30％。
9. 向超声处理的细菌样品中加入1％Triton-X。在4℃下摇匀20-30分钟
10. 同时，用0.1％Triton-X在PBS中洗涤谷胱甘肽Sepharose 4B珠珠3次。将200μl珠子用于500ml细菌培养。
11. 在4℃下以10,000×g / min旋转细菌30分钟。
12. 收集上清液并加入珠粒。在4℃下旋转过夜。
13. 在4℃下以500×g离心珠离心5分钟。
14. 用PBS + 0.1％Triton-X洗3次，每次5分钟。
15. 加入500μl洗脱缓冲液，4°C旋转1 h。
16. 在4℃下将样品在500℃下旋转5分钟。
17. 再次重洗。
18. 在4℃下收集透析缓冲液的洗脱液两次。
19. 快速冻结蛋白质并储存于-80°C
LATS体外激酶测定
1. 将HEK293A细胞在含有10％胎牛血清（FBS）的Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）中培养。
2. 将细胞以每板1.5×10 6的密度接种在10cm平板中，并在37℃，5％CO 2/2下孵育至80％汇合。阳性对照可以是血清饥饿30分钟的细胞（图2）
3. 用冷PBS洗涤细胞。
4. 除去PBS，并用1ml冷的轻度裂解缓冲液（参见Recipes），补充有1x蛋白酶抑制剂，1×磷酸酶抑制剂和1mM PMSF来清洗细胞。将细胞转移到1.5ml Eppendorf管中。
5. 将样品在冰上孵育10分钟。
6. 在4℃下将裂解物以12,000xg旋转15分钟。
7. 收集上清液，每个样品1μlLATS1抗体在4°C恒定旋转过夜孵育过夜。
8. 使用磁性架，用轻度裂解缓冲液洗涤磁珠（每个样品10μl）3次。将磁珠重悬于50μl轻度裂解缓冲液中，并加入裂解液中。在4°C旋转1小时。
9. 使用磁性架，在4℃下，每个样品洗1次（每次10分钟），每次1ml温和裂解缓冲液。
10. 在4℃下，每个样品用1ml 1x TBS（参见食谱）洗涤样品一次10分钟。
11. 在用TBS洗涤的同时，制备激酶反应的主混合物。每个激酶反应在40μl反应混合物中含有4μl10x激酶缓冲液，500μM冷ATP和1μgGST-YAP。
12. 旋转样品并使用磁性架拆除TBS。在每个反应中加入40μl的主混合物。
13. 将反应混合物在30℃下摇动30分钟。
14. 加入4x SDS样品缓冲液以停止反应，并将样品在100℃下加热5分钟。
15. 然后将样品进行SDS-PAGE和Western印迹。

数据分析

山梨醇或血清饥饿诱导的LATS活性可以通过检测HM的LATS的磷酸化来测定（图1）。 LATS的直接激酶活性可以通过检测LATS体外激酶测定中YAP的磷酸化水平来测量（图2）。增加的YAP磷酸化代表增加的LATS激酶活性

图1.血清饥饿和山梨醇诱导的渗透胁迫诱导LATS HM磷酸化。 HEK293A细胞在存在或不存在血清的情况下用0.2M山梨糖醇处理30或60分钟。用磷酸特异性pLATS抗体检测疏水基序（HM）处的LATS磷酸化。（pLATS-HM Ab 1：1,000稀释，LATS1 Ab 1：2,000稀释，含有TBST的5％BSA中的GAPDH Ab 1：2,000稀释度）。

图2.通过LATS体外激酶测定测定的激酶活性。 HEK293A细胞血清饥饿或用0.2M山梨糖醇处理30分钟。 LATS1被免疫沉淀，并使用重组GST-YAP作为底物进行体外激酶测定。通过用磷酸-YAP（S127）抗体的免疫印迹测定YAP的磷酸化。（pYAP S127 Ab 1：1,000稀释，GST Ab 1：2,000稀释，LATS1 Ab 1：2,000稀释于含有TBST的5％BSA中）。

食谱

洗脱缓冲液
50mM Tris pH 8.0
20 mM谷胱甘肽
注意：准备新鲜。
透析缓冲液
20 mM Tris pH 8.0
2mMβ-巯基乙醇
100 mM NaCl
10％甘油
注意：准备新鲜。
4x SDS样品缓冲液
200 mM Tris pH 6.8
8％SDS
0.1％溴酚蓝
40％甘油
20％β-巯基乙醇
注意：在室温下保存。
轻度溶解缓冲液
20mM Tris pH7.5
100 mM NaCl
50 mM NaF
2 mM EDTA
1％NP-40替代品
注意：存储在4°C。
TBS缓冲区
20mM Tris-HCl pH 7.5
170 mM NaCl
注意：在室温下保存。

致谢

这个协议是从Yu等人改编而来的。（2012）和Hong等人（2017）。 A.W.H.部分由T32 GM007752培训补助金支持。 K.L.G.得到了国家卫生研究院的资助（CA196878，GM051586）

参考

Hong，AW，Meng，Z.，Yuan，HX，Plouffe，SW，Moon，S.，Kim，W.，Jho，EH and Guan，KL（2017）。＆nbsp; 通过NLK在Ser128的渗透应激诱导的磷酸化激活YAP。 EMBO Rep 18（1）：72-86。

Yu，FX，Zhao，B.，Panupinthu，N.，Jewell，JL，Lian，I.，Wang，LH，Zhao，J.，Yuan，H.，Tumaneng，K.，Li，H.，Fu，XD ，Mills，GB and Guan，KL（2012）。＆nbsp; 通过G蛋白偶联受体信号调节Hippo-YAP途径。 150（4）：780-791。

Zhao，B.，Wei，X.，Li，W.，Udan，RS，Yang，Q.，Kim，J.，Xie，J.，Ikenoue，T.，Yu，J.，Li，L.，Zheng ，P.，Ye，K.，Chinnaiyan，A.，Halder，G.，Lai，ZC and Guan，KL（2007）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http： ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17974916“target =”_ blank“>通过Hippo途径失活YAP癌蛋白参与细胞接触抑制和组织生长控制。 Genes Dev 21（21）：2747-2761。