材料和试剂

100毫米组织培养皿（康宁，目录号：430167）
1.5和2ml微量离心管（Eppendorf）
Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K或Centricon ultracel YM-30（EMD Millipore，目录号：UFC503024）
Spherisorb NH2柱，5μm，4.6×250mm（WATERS，目录号：PSS831115）
HEK-293细胞（ATCC，目录号：CRL-1573）
Dulbecco修改的Eagle's培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：41965039）
Dulbecco修改的Eagle's中等葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D5030）
胎牛血清（FBS）（Biological Industries，目录号：04-001-1A-US）
胎牛血清（FBS），透析（Biological Industries，目录号：04-011-1A-US）
丙酮酸钠溶液（100mM）（Sigma-Aldrich，目录号：S8636）
甘露糖，D- [2- 3 H（N）] - （比活度：15-30Ci / mmol）（PerkinElmer，目录号：NET570A）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D1408）
蛋白A琼脂糖珠，IPA 300（REPLIGEN，目录号：10-1003）
我们实验室生产的兔多克隆抗H2羧基末端（Tolchinsky等，1996）
Endo H 试剂盒（1,000,000 U / ml）（New England Biolabs，目录号：P0703S）
通过糖蛋白代谢标记用[14 C]或[3 H]制备的标准寡糖混合物，并用内容物H分离
乙腈LiChrosolv（梯度级液相色谱）（Merck，目录号：100030）
磷酸溶液（HPLC为49-51％）（Sigma-Aldrich，目录号：79607）
Opti-Fluor闪烁液（PerkinElmer，目录号：6013199）
Triton X-100（BDH，目录号：306324N）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P2714）
脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：30970）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610301）
磷酸钠（Na 3 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：342483）
缓冲液A（参见食谱）
缓冲区D（见配方）
HPLC溶剂（参见食谱）

设备

Eppendorf离心机（Eppendorf，型号：5415 D）
CO 2 孵化器
-80°C冰箱
LS 6500液体闪烁计数系统（Beckman Coulter，型号：LS 6500，目录号：510720）
600E多溶剂输送系统控制器（HPLC）（WATERS，目录号：WAT062710）
注意：本产品已停产。
SpeedVac集中器5301，包括48×1.5 / 2.0ml固定角转子（Eppendorf，型号：Concentrator 5301，目录号：5301 000.016）
Frac-100馏分收集器（Amersham Biosciences，型号：FRAC-100，目录号：18-1000-77）
Vibra-Cell超声波处理器VCX 750（Sonics and Materials，型号：VCX 750，目录号：690-003）

程序

200的X- 200 X- 200 200 200 200 200 200 CE 200 200 200 200 200 -40 200 200 -40 200 200 200 200 200 200 200：1992 200 200 Chanolololol。这里使用在90mm培养皿中生长的HEK293细胞。在实验前24小时，根据磷酸钙方法进行HEK 293细胞（约2×10 6）的转染。可以使用其他转染方法。
从90毫米的培养皿中取出生长培养基，用完全的DMEM刮洗细胞并转移到2ml的Eppendorf管中。旋转细胞（6,000秒16,000 x g），并用2 x 1毫升无葡萄糖培养基冲洗。通过在1升新鲜制备的预热（37℃）无葡萄糖的培养基中，将10％透析的FBS和4mM丙酮酸钠在CO 2中温育30分钟，将细胞从葡萄糖中分离出来，培养箱在37°C（图1）。在37℃下孵育过程中，将管盖打开。在Eppendorf管中的标记允许在以下步骤中使用小体积的中等和放射性前体。

X-454545454545 X-45454545 X- 20045 X-45454545新新新新新新新新新旗新新200新新新新旗新新旗新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新新新新新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新旗新新新新新新新旗新新旗新新旗新新旗旗号图1.实验程序流程图
用含有10％透析的FBS，4mM丙酮酸钠和400μCi的[2- 3> H]标记的甘露糖的1ml预热（37℃）无葡萄糖培养基代替饥饿培养基X- 200 200 200 200 200 200 -40 200 200 -40 200 200 X- 200 200 200 X- 200 200 200 -40 200 200 200 200 200 200 200：下目录200：200454545“
X- 20045 X- 200 X- 200 200 X- 200 X- 200 X- 200 X- 200 X- 200 X- 200 X- 200 X- 200 X- 200 X- 200 X- 200 X- 200 X- 200 200 200 200 200 200： ℃）正常的完全培养基，然后在37℃下加入1ml预热的正常完全培养基的CO 2培养箱中达到所需的追踪时间（通常为30分钟至8小时），取决于所研究的蛋白质的周转量）
用1ml冰冷的PBS冲洗脉冲样品3次。
新新新新旗新新新旗新新新旗新新新旗新新旗旗新新新旗新新旗旗新200 200 200 200 200 200：200旗新旗旗新新旗旗新200 200 200 200 200 200 200 200:刑200新新新新旗新新旗新新旗旗新200 200 200 200 200 200：
在追逐时间结束时也执行步骤5和6
从冷冻箱中取出细胞，加入400μl缓冲液A进行裂解，短暂涡旋，冰上孵育30分钟。
在4℃下以16,000×g离心裂解物30分钟。将上清液转移到新的1.5 ml Eppendorf管中，弃去沉淀。
对于数据分析中所示的H2a糖蛋白的免疫沉淀，向步骤9的上清液中加入20μl/μl蛋白A琼脂糖珠1:1的悬浮液和5μl/兔多克隆抗H2a抗体样品。
在4℃下孵育样品4-16小时，通过缓慢旋转持续混合。
以16,000 x g 旋转珠子30秒，小心取出上清液。
通过加入500μl缓冲液D和涡旋洗涤珠子。如步骤12旋转并除去上清液。重复冲洗3次。
将20μl变性缓冲液（NEB endo-H试剂盒提供）加入珠粒，煮沸样品5分钟。
将珠子（16,000 x g 旋转30秒），并将上清液转移到新的Eppendorf管中。然后向每个样品中加入0.5μl内切酶酶，并加入2μl反应缓冲液（也随NEB endo-H试剂盒提供），样品在37℃下孵育3小时。
为了将释放的聚糖与蛋白质分离，将样品用双蒸水（DDW）稀释5倍，并置于分子过滤器（Microcon Ultracel YM30）的顶部，以30kDa的截止值离心，然后以14,000 xg 3分钟（过滤器必须用0.5ml DDW洗涤，并在加载样品之前以14,000 xg离心3.5分钟）。将100μl的DDW加入到含有H反应的Eppendorf管中并转移到相应的分子过滤器中。重复样品离心。这次冲洗再次重复1次，保持流量（总生产量约为300μl）
在闪烁计数器（30μl）中检查10％。如果达到至少100厘泊，请继续下一步。少于此数量将不足以进行进一步分析。
将含有内-H反应流的管（步骤16和17）置于SpeedVac浓缩器中，并将样品完全干燥（这可以在45℃下完成，以加速该过程，通常需要1-2小时）。
为了制备HPLC样品，将干燥的沉淀重悬于12μl的HPLC溶剂（乙腈：水，63:37，2.5％的磷酸）中。
调整HPLC装置（连接到Spherisorb色谱柱）以保持溶剂的恒定流量（1 ml / min）和压力（1,000至2,000 psi的值），并放置一个级分收集器，每1分钟更换一次。 />
将样品装入HPLC装置并同时启动级分收集器。
从每个样品运行和一批标准寡糖混合物中收集65份1ml的级分。我们使用通过糖蛋白代谢标记制备的标准混合物，并用内切-H（Armando Parodi的礼物）分离。
从每个部分转移500μl到闪烁瓶，并将内容物与3 ml水混溶性闪烁液（Opti-fluor）混合。
加载小瓶，并使用[3 H]的设置读入闪烁计数器。
cpm读数作为分数的函数作图。
峰值内的cpm值表示根据标准寡糖混合物的平行运行鉴定的特定聚糖物种。
每个峰内部分的cpm值的总和反映了特定聚糖物种的绝对量。为了补偿含有更多甘露糖残基的物质获得更多标签的事实，每个聚糖物种的“相对摩尔数”如下计算：每个聚糖物质的cpm中绝对量除以甘露糖残基数它含有“相对摩尔量”。然后将该值除以所获得的所有聚糖物质的相对摩尔量的总和，以获得每个特定聚糖物质的“总摩尔百分比”（图2）。使用此过程的示例如图3所示。

图2.计算相对摩尔量的示例

数据分析

在表达ERAD底物H2a的细胞中测试了ManIA的击倒作用，用[2- 3 H] Man标记。将细胞裂解，将H2a免疫沉淀并用内切-H处理。通过HPLC分离N-连接的寡糖，并在β计数器中计数级分。 M9至M5代表Man <5> GlcNAc 2 的Man 9 GlcNAc 2 。基于甘露糖含量计算每种寡糖物质的相对摩尔量。我们转化了每个聚糖物种获得的cpm值，然后绘制每个物种的百分比相对于存在的所有物质的相对摩尔量的总和的总和。只显示3 h追逐的值。进行了三次独立的生物复制实验（图3）

图3.修剪ERAD底物糖蛋白上的高甘露糖残基和Man1A的要求。用H2S编码载体与pSUPER编码对照抗lacZ shRNA（A）或抗Man1A shRNA（B）共转染的HEK 293细胞用[2- 3' / sup> H]在无葡萄糖培养基中的人，并在完全培养基中追踪0或3小时。 C. Man1A的敲低显着抑制了广泛的甘露糖修剪，导致Man 9 / GlcNAc 2（M9）的积累。显示了三个独立生物重复实验的一个代表性实验。 D.标准品[M]〜M5寡糖混合物。

笔记

应根据您所在机构的规定，收集和储存在不同步骤中生产的放射性废物。

食谱

缓冲区A
1％Triton X-100
0.5％（w / v）脱氧胆酸钠
蛋白酶抑制剂混合物2％v / v in PBS
缓冲区D
0.5％Triton X-100
0.25％（w / v）脱氧胆酸钠
0.5％（w / v）SDS
蛋白酶抑制剂混合物2％（v / v）在PBS中

注意：可以制备储存（5x）缓冲液A和D，并以-20℃的等分试样储存。新鲜的蛋白酶抑制剂鸡尾酒应该在使用前加入。
HPLC溶剂
63％乙腈
37％DDW
2.5％磷酸

致谢

与这项工作有关的研究得到以色列科学基金会（1593/16）和Recanati基金会的资助。相关协议可以在Avezov等人，2010中找到。

参考

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