材料和试剂

10厘米直径的培养皿
拟南芥生态型哥伦比亚种子（最初从NASC，诺丁汉拟南芥股票中心获得）
甜食青椒水果由先正达种子S.A.（El Ejido，西班牙）提供
70％（v / v）乙醇
0.1％（w / v）SDS
商业漂白剂
Murashige和Skoog培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5524）
植物琼脂（Duchefa Biochemie，目录号：P1001）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
Bio-Rad蛋白测定（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
牛血清白蛋白（BSA）组分V（Roche Diagnostics，目录号：10735078001）
Tris（AMRESCO，目录号：0497）
乙二胺四乙酸，二钠盐，二水合物（Na 2 -EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
Triton X-100（AMRESCO，目录号：0694）
甘油（AMRESCO，目录号：E520）
二硫苏糖醇（DTT）（Roche Diagnostics，目录号：10708984001）
30％丙烯酰胺/ Bis溶液，19：1（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610154）
4x凝胶缓冲液
甘氨酸（AMRESCO，目录号：0167）
过硫酸铵
TEMED
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠，钠盐，水合物（NADP）（Sigma-Aldrich，目录号：N0505）
氯化镁，六水合物（MgCl 2·7H 2 O）（EMD Millipore，目录号：442615）
Nitroblue四唑（NBT）（AMRESCO，目录号：0329-1G）
异硫氰酸苯酯（PMS）（Sigma-Aldrich，目录号：P9625）
6-磷酸葡萄糖酸，三钠盐（6PG）（Sigma-Aldrich，目录号：P7877）
冰醋酸（Fisher Scientific）
研磨缓冲液（见配方）
6％丙烯酰胺凝胶上的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（参见食谱）
染色溶液（参见食谱）
停止解决方案（请参阅食谱）

设备

植物生长箱（Panasonic Biomedical，型号：MLR-352-PE）
瓷砂浆和杵
冷藏离心机
垂直平板凝胶电泳系统（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-PROTEAN 电泳池）

软件

ImageJ程式（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

植物提取物
1. 表面消毒拟南芥在室温和轻微摇动下在含有0.1％（w / v）SDS的70％（v / v）乙醇中生殖型Columbia种子5分钟。然后，在含有20％（w / v）商业漂白剂和0.1％（w / v）SDS的无菌水中放置20分钟，然后在无菌水中洗涤四次。
2. 在含有1％（w / v）蔗糖和0.8％（w / v）植物琼脂（Corpas and Barroso，2014）的pH 5.5的商业Murashige和Skoog培养基（Sigma-Aldrich）上培养Petri板上的种子。然后，将幼苗保持14天，光照时间为16小时（光强度为100μEm -2至 sec ^{-1），黑暗8小时，温度为22°C和18°C。}
3. 甜瓜青椒水果由先正达种子S.A.（El Ejido，西班牙）从实验温室种植的植物提供。
4. 用研磨缓冲液（参见食谱）将植物样品以拟南芥为1:3（w / v）的比例均匀化，胡椒水果的比例为1:1。在0-4°C（冰上）进行这些操作。
5. 离心机在4℃下以27,000 x g离心提取20分钟
6. 使用上清液进行酶测定。使用牛血清白蛋白作为标准，用Bio-Rad蛋白测定（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）测定蛋白质浓度。
6PGDH活性染色
1. 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）在4-7℃下在6％丙烯酰胺凝胶上分离植物蛋白。通常需要2小时30分钟。
2. 电泳后，在室温（RT）下，在染色溶液中孵育凝胶（参见食谱）。保持在黑暗中摇动，直到蓝紫色的乐队出现在无色的背景。大约需要15分钟（图1）
3. 去除染色溶液并加入终止溶液（参见食谱）以覆盖凝胶。
  
  图1.通过非变性凝胶电泳分析6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）同种型。：一种。通过天然PAGE（6％）分离6PGDH同工型活性，并通过活性染色鉴定。第1号，拟南芥拟南芥 14日龄幼苗。车道2，甜青椒水果。 B. 6PGDH同种型的光密度扫描及其由ImageJ程序进行的相对定量（％）。
注意：建议使用新鲜蔬菜提取物，因为它们提供更好的定义的活动范围。

数据分析

每个6PGDH同种型的活性的定量可以通过光密度分析（图1B）进行，例如使用ImageJ程序。

食谱

研磨缓冲区
含有0.1mM EDTA的50mM Tris-HCl，pH 7.8 0.2％（v / v）Triton X-100
200新新200新200新新200新新200新新200新新200新新200新新200新新200新新200新200新新200新新200新200人200 200“ 2 mM DTT
6％丙烯酰胺凝胶上的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 30％丙烯酰胺/双溶液，19：1
4倍凝胶缓冲液（1.5M Tris-HCl，pH8.9）电极缓冲液（38mM甘氨酸加5mM Tris，pH 8.2） 10％（w / v）过硫酸铵（AP）
TEMED
下表显示了要在Bio-Rad Mini-PROTEAN电泳系统中使用的两个1.5毫米厚凝胶的每种试剂所需的体积

注意：每次使用之前都会添加。试剂的混合物应在4℃（冰上）进行。

标准运行条件为每凝胶15mA 30分钟，然后每凝胶增加至25mA约90分钟。电泳应在寒冷的房间（5-7°C）内运行
染色溶液
含有0.8mM NADP的50mM Tris-HCl，pH 7.6 5 mM EDTA
2mM MgCl 2
0.24 mM NBT
65 mM PMS
10 mM 6PG
注意：使用前准备好并保护光线。
停止解决方案
7％（v / v）乙酸

致谢

这项工作得到西班牙经济与竞争力部的ERDF-cofinanced grant AGL2015-65104-P的支持。

食谱

研磨缓冲区
含有0.1mM EDTA的50mM Tris-HCl，pH 7.8 0.2％（v / v）Triton X-100
200新新200新200新新200新新200新新200新新200新新200新新200新新200新新200新200新新200新新200新200人200 200“ 2 mM DTT
6％丙烯酰胺凝胶上的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 30％丙烯酰胺/双溶液，19：1
4倍凝胶缓冲液（1.5M Tris-HCl，pH8.9）电极缓冲液（38mM甘氨酸加5mM Tris，pH 8.2） 10％（w / v）过硫酸铵（AP）
TEMED
下表显示了要在Bio-Rad Mini-PROTEAN电泳系统中使用的两个1.5毫米厚凝胶的每种试剂所需的体积

注意：每次使用之前都会添加。试剂的混合物应在4℃（冰上）进行。

标准运行条件为每凝胶15mA 30分钟，然后每凝胶增加至25mA约90分钟。电泳应在寒冷的房间（5-7°C）内运行
染色溶液
含有0.8mM NADP的50mM Tris-HCl，pH 7.6 5 mM EDTA
2mM MgCl 2
0.24 mM NBT
65 mM PMS
10 mM 6PG
注意：使用前准备好并保护光线。
停止解决方案
7％（v / v）乙酸

致谢

这项工作得到西班牙经济与竞争力部的ERDF-cofinanced grant AGL2015-65104-P的支持。

参考

Corpas，FJ和Barroso，JB（2014）。＆nbsp; 过氧亚硝酸盐（ONOO ^{- ）是在拟南芥过氧化物酶体内产生的，并且在镉胁迫下过度产生。 Ann Bot 113（1）：87 -96。}
公司，FJ，Barroso，JB，Sandalio，LM，Distefano，S.，Palma，JM，Lupiáñez，JA和delRío，LA（1998）。＆nbsp; 植物过氧化物酶体中NADPH的脱氢酶介导的再循环系统。生物化学J 330（Pt 2 ）：777-784。

Fernández-Fernández，AD和Corpas，FJ（2016）。分析拟南芥过氧化物酶体6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶。科学（开罗） 2016 ：3482760.

Hölscher，C.，Lutterbey，MC，Lansing，H.，Meyer，T.，Fischer，K.and von Schaewen，A.（2016）。＆nbsp; 过氧化物酶体六磷酸葡萄糖酸脱氢酶同种型PGD2中的缺陷阻止拟南芥中的配子体相互作用。 >植物生理学 171（1）：192-205。

Krepinsky，K.，Plaumann，M.，Martin，W.and Schnarrenberger，C.（2001）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov / pubmed / 11322889“target =”_ blank“>从菠菜纯化和克隆叶绿体6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶。在真核染色体中编码的叶绿体和细胞溶质同功酶的蓝细菌基因。 Eur J Biochem 268（9）：2678-2686。

Mateos，RM，Bonilla-Valverde，D.，delRío，LA，Palma，JM and Corpas，FJ（2009）。＆nbsp; 来自胡椒水果的NADP-脱氢酶：成熟的作用。生理植物135（2）：130-139。 />