材料和试剂

移液器提示
1.5ml离心管（Eppendorf Safe-Lock微量离心管）（Eppendorf，目录号：0030120086）
15ml离心管（TubeSpin Bioreactor 15）（TPP Techno Plastic Products，目录号：87015）
50 ml离心管（TubeSpin ®/ > Bioreactor 50）（TPP Techno Plastic Products，目录号：87050）
集胞藻 sp。 PCC 6803细胞（巴斯德文化收集蓝细菌）（Institut Pasteur，目录号：PCC 6803）
碎冰
双蒸水
0.5N氢氧化钠（NaOH）（Carl Roth，目录号：9356.1）
1N盐酸（HCl-ROTIPURAN 37％）（Carl Roth，目录号：X942.1）
50mM Tris-盐酸盐，pH8.5（PUFFERAN≥99％）（Carl Roth，目录号：9090.3）
20mMβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH / H + ），还原的二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：N9785）
注意：本产品已停产。
1mMβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH +），还原的二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：N0632）
5mM吩嗪甲硫酸盐（PMS）（Sigma-Aldrich，目录号：P9625）
5mM哌嗪 - 四氢呋喃（INT）（Sigma-Aldrich，目录号：I8377）
摩尔质量为104.10g / mol的1mM（R，R）-3-羟基丁酸（R-3-HB）（Sigma-Aldrich，目录号：54920）
15U / ml来自球状红细菌的3-羟基丁酸脱氢酶（3-HBDH）II级（Roche Diagnostics，目录号：10127833001）
BG11储备液'+ N';高压灭菌（使用1：100）（见配方）

硝酸钠（NaNO 3 <99％，p.a.，ACS，ISO）（Carl Roth，目录号：A136.1）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O <99％，p.a.，ACS）（Carl Roth，目录号：5239.1）
柠檬酸（C 6 H 8 O 7≥99.5％，pa，ACS，无水）（Carl Roth，目录号：X863.1 ）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O≥99％，p.a.，ACS）（Carl Roth，目录号：P027.1）
乙二胺四乙酸二钠盐脱水（EDTA≥99％，p.a.，ACS）（Carl Roth，目录号：8043.2）

BG11 <0>储备液'-N';高压灭菌（使用1：100）（见配方）

氯化钙（CaCl 2·2H 2 O <99％，p.a.，ACS）（Carl Roth，目录号：5239.1）
柠檬酸（C 6 H 8 O 7≥99.5％，pa，ACS，无水）（Carl Roth，目录号：X863.1 ）
硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O≥99％，p.a.，ACS）（Carl Roth，目录号：P027.1）
乙二胺四乙酸二钠盐脱水（EDTA≥99％，p.a.，ACS）（Carl Roth，目录号：8043.2）

用于BG11的痕量金属混合物无菌过滤（使用1：1,000）（见配方）

硼酸（H 3 3 BO 3）（≥99.8％，p.a.，ACS，ISO）（Carl Roth，目录号：6943.2）
（II）氯化四水合物（MnCl 2·4H 2 O≥99％，p.a.）（Carl Roth，目录号：T881.3）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O≥97％，特别纯）（Carl Roth，目录号：7316.1）
钼酸钠二水合物（Na 2 MoO 4·2H 2 O），≥99.5％（Sigma-Aldrich，目录号：M1651）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O≥99％，Ph.Eur。，BP）（Carl Roth，目录号：P025.1） br />
硝酸钴（II）六水合物（Co（NO 3 3）2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：203106） br />

BG11额外解决方案;无菌过滤（使用1：1,000）（见配方）

柠檬酸铵（III）（Carl Roth，目录号：9366.1）
磷酸氢二钾（K 2 O 3 HPO 4％≥98％，Ph.Eur。，BP）（Carl Roth，目录号：T875.1）
碳酸钙一水合物（Na 2 CO 3·H 2 O≥99.5％，pa，ACS）（Carl Roth，目录号：2597.2 ）

BG11缓冲溶液;高压灭菌（使用1：200）（参见食谱）
1 M HEPES缓冲液（pH 8.0）（PUFFERAN ≥99.5％）（Carl Roth，目录号：9105.4）
BG11（'+ N'）介质（参见食谱）
BG11 <0>（'-N'）介质（参见食谱）

设备

宽颈500ml锥形瓶（Carl Roth，DURAN ，目录号：C150.1）
个人防护装备（PPE）
注意：处理浓缩酸和碱时，应始终佩戴这些。请参阅注3。

安全眼镜（Sekuroka ®安全眼镜EN166）（Carl Roth，目录号：Y254.1）
实验室外套（Sekuroka ® -lab大衣）（Carl Roth，目录号：T413.1）
手套（Rotiprotect ® -nitrile evo）（Carl Roth，目录号：CPX7.1）

移液器套件（Rainin Pipet-Lite LTS入门套件L-STARTXLS +）（Mettler-Toledo International，目录号：17014406）
冰桶
层流流量台（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：MSC-Advantage TM II类，目录号：51028225）
分析天平（Mettler-Toledo International，型号：XS105）
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus TM Biofuge TM Primo R，目录号：75005440）
光度计（LI-COR，型号：LI-189）
孵化器（Infors，型号：Multitron Pro，'Algae Special'）
UV-Vis分光光度计（分析耶拿，型号：Specord ® 50 PLUS）
台式pH / mV /℃表（pH 1,000L，pHenomenal ）（VWR，目录号：662-1422）
Thermomixer（Biometra，型号：ThermoShaker TS1，目录号：846-051-500）
涡旋振动筛（VWR，Peqlab，型号：peqTWIST）
高压灭菌器（Systec，型号：Systec VX-150）

程序

诱导集落藻的PHB生物合成PCC 6803脱氮

对于如（Grundel等人，2012; Damrow等人，2016）中所述的氮降压实验，将集胞藻的无菌预培养物 sp。 PCC 6803（2×250ml）在锥形烧瓶中在28℃下连续照射80微摩尔光子的光秒，在OD 750在含有20mM HEPES缓冲液（pH8.0）和17.6mM硝酸钠作为氮源的BG11培养基（参见食谱）中 -1 。
对于氮缺乏，通过在室温下以4,000xg离心10分钟使细胞（500ml）沉淀，并用500ml BG11.0（参见食谱）洗涤两次，其中缺乏硝酸钠“-N”（Stanier等人，1971）。
将最终的细胞悬浮液分开（2×250ml），并且如（Hein等人）所述，用乙酸钠（终浓度为10mM）补充两种培养物的“N”和“+ N” ，1998）。硝酸钠仅加入对照'+ N'样品（终浓度17.6mM）。
在氮缺乏条件下的培养同样适用于在锥形培养瓶中，在28℃，连续振荡（80rpm; Multitron Pro'Algae Special'）下进行的培养前培养，并使用白光（80μmol光子m -2 sec -1 ）七天。

干重定量

通过离心（4,000 xg，10分钟）将10ml细胞培养物沉淀，用10ml无菌水洗涤两次，最后浓缩至1ml，并转移到1.5ml反应管中，该反应管必须预先加权。
在另一个离心步骤（10,000×g，3分钟）后，将上清液完全除去，剩余的细胞沉淀物在80℃下在温热混合器中完全干燥过夜（开盖）。
细胞的干重（〜5mg）由管子的体重减去的“细胞管”的重量确定（表1）。

表1.确定的干重

通过碱性水解将PHB萃取和去聚合（（R））-3-羟基丁酸（图1）。

图1.聚 - β-羟基丁酸酯（PHB）的水解降解（ R-3-HB）

将0.5N NaOH（<5mg DW→300μl0.5N NaOH;> 5mg DW→400μl0.5N NaOH）加入到步骤2（'+ N'和'-N'的干燥的细胞沉淀中，分别），并在85℃下在恒温混合器中连续摇动孵育1小时，并随时剧烈涡旋以破坏细胞并将PHB水解成其单体（R）-3-羟基丁酸酯（（Yu和Marchessault，2000; Cui等人，2006）所述的R-3-HB）。
在冰上冷却后，样品（'+ N'和'-N'分别）通过加入1N HCl以四体积0.5N NaOH（例如，300μl ）至一体积1N HCl（例如，100μl）。样品（'+ N'和'-N'分别）通过涡旋充分混合。
然后通过离心（1分钟，4500分钟）从每个样品（'+ N'和'-N'分开地）含有R-3-HB的级分（上清液）分离出细胞碎片，室温）。将含有R-3-HB的级分（上清液）转移到每个样品的新的1.5ml反应管（分别为'+ N'和'-N'）。
对于进一步的定量分析，将含有R-3-HB的样品（'+ N'和'-N'分别）以1:10稀释的比例用双蒸水稀释。

R-3-HB单体的分光光度定量

每个样品中的R-3-HB含量（'+ N'和'-N'分别）最终通过酶测定法进行分光光度法定量。在氧化还原反应中，R 3-HB被氧化成乙酰乙酸酯，而NAD + 被还原成NADH / H +催化的3-羟基丁酸脱氢酶（HBDH）（图2）

图2.通过3-羟基丁酸脱氢酶的R-3-HB氧化的偶联酶测定和NADH / H的同时再氧化 >到达由PMS-INT系统形成稳定的颜色沉淀 >
为了防止反应（乙酰乙酸酯还原为R-3-HB; NADH / H + 氧化成NAD ），NADH / H 如（Lim and Buttery，1977; Hinman and Blass，1981）所述，合成直接与吩嗪亚硫酸氢盐 - 对碘硝基四唑紫（PMS-INT）比色测定法结合。这里，电子以1:1的化学计量从NADH / H + 通过PMS转移到INT。 INT的还原形式是稳定的甲an，其吸收波长为500nm（或505nm）的光（Lim和Buttery，1977）（图2）。
R-3-HB的水平与合成的NADH / H + 和甲the的水平成正比（图2）。
将100μl来自步骤3的稀释样品或100μl1mM标准（（R）-3-羟基丁酸）加入到含有（每个样品一式三份）的比色皿（1ml测定体积）中：
730μl50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.5（氧化反应的最适pH）
50μl1mM NAD +
10μl0.5 mM PMS
100μl0.05 mM INT
在分光光度计之前（E1 ）和10分钟后，在25℃下将反应监测为A500（或505nm）中的变化（ΔE= E2-E1 ）（Hinman和Blass，1981）中描述的方案（表2），用10μl15U / ml HBDH引发（E2）启动。使用Tris-HCl缓冲液，pH8.5（50mM）作为空白
表2.缺氮样品的500nm（或505nm）吸收变化
通过六个不同的NADH / H + 浓度范围为0，（0.1），0.25,0.5,0.75和1.0mM的校正系列计算R-3-HB（和因此PHB）水平（每种浓度一式三份）在PMS-INT形式反应中。使用Tris-HCl缓冲液，pH8.5（50mM）作为空白。这里，ΔE（表3）在25℃下作为在分光光度计之前（E1 ）和3分钟后（（E1））的A500（或505nm） E2）将100μl各自的NADH / H +标准溶液加入到含有（每个样品一式三份）的比色皿中：
730μl50mM Tris-HCl缓冲液，pH8.5
60μl双蒸水
10μl0.5 mM PMS
100μl0.05 mM INT

表3. NADH校准系列的500nm（或505nm）吸收变化

数据分析

NADH / H + 标准曲线
将校准曲线作为各自吸光度（ΔE值）与已知浓度的NADH / H + [mM]的函数作图。拟合曲线和参数通过线性回归分析得到。线性回归系数应在0.97≤R 2 <1> <1>的范围内（图3）。 br />

图3. NADH / H + 校准曲线
R-3-HB标准对照反应
假设完全化学转化（1:1化学计量），对照反应（0.1mM R-3-HB）的相应吸光度对应于0.1mM NADH / H +（参见NADH / H + 标准曲线，图3）。
PHB水平量化与干重相关
从每个吸光度的线性回归分析的斜率函数（ΔE值）计算转化的NADH / H + ，从而计算R-3-HB浓度。将所有稀释度和浓度因子包括在方程式中，所有三个重复的平均R-3-HB量与确定的干重相关（表4）。而在对照样品中，+ N'不能检测到R-3-HB，所以集胞藻的缺氮细胞的平均R-3-HB（因此PHB）含量。 PCC 6803对应于干重的6-10％（Damrow等人，2016）。

表4.每干重PHB含量的测定

笔记

所有细胞通道和培养基在无菌条件下使用层流台和高压釜进行。光合有效辐射（PAR）的强度以μEm -2 sec -1 （μmol光子/ m 2 /秒和秒）测量，使用一个LI-189光度计。
干燥的细胞沉淀物在4℃下储存至少三周。
出于安全考虑，在处理酸碱时应调整保护措施和紧闭管。为安全起见，请确保在添加HCl之前将热样冷却下来。含有R-3-HB单体的上清液可以在-20°C储存至少三周
PMS-INT反应是光敏感的。样品在黑暗中处理。

食谱

注意：除非另有说明，否则使用双蒸水作为溶液中的溶剂

BG11储备液'+ N';高压灭菌（使用1：100）
17.65 M NaNO 3
0.18M CaCl 2·2H 2 O
0.0031 M柠檬酸
0.304M MgSO 4·7H 2 O
0.0034 M EDTA
BG11储备液'-N';高压灭菌（使用1：100）
0.18M CaCl 2·2H 2 O
0.0031 M柠檬酸
0.304M MgSO 4·7H 2 O
0.0034 M EDTA
用于BG11的痕量金属混合物无菌过滤（使用1：1,000）
3.43g / L H 3/3 3/3
0.09g / L MnCl 2·4H 2 O
0.11g / L ZnSO 4·7H 2 O
0.195g / L Na 2 MoO 4·2H 2 O
0.0395g / L CuSO 4·5H 2 O
0.0247g / L Co（NO 3 3）2·6H 2 O
BG11额外解决方案;无菌过滤（使用1：1,000）
23 mM柠檬酸铁铵
172mM K 2 HPO 4
188mM Na 2 CO 3 / H 2 O 2 / /
BG11缓冲溶液;高压灭菌（使用1：200）
1 M HEPES缓冲液（pH 8.0）
BG11（'+ N'）
10 ml 100x BG11（+ N）储备溶液
1毫升痕量金属混合物
1毫升23毫克柠檬酸铵柠檬酸铵 1毫升172毫克磷酸氢钾二价 1ml 188mM碳酸钠
5 ml 1 M HEPES缓冲液（pH 8.0）
用去离子水加至1升
BG11 0 （'-N'）
10 ml 100x BG11（-N）储备溶液减少了硝酸钠 1毫升痕量金属混合物
1毫升23毫克柠檬酸铵柠檬酸铵 1毫升172毫克磷酸氢钾二价 1ml 188mM碳酸钠
5 ml 1 M HEPES缓冲液（pH 8.0）
用去离子水加至1升

致谢

我们特别感谢沃尔夫冈·洛克对他的承诺和宝贵的讨论，并持续支持我们的研究。我们非常感谢Gisa Baumert（德国柏林洪堡大学）的出色技术援助。我们感谢Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG）在“关于蛋白质功能的质子化动力学”（SFB1078，A4 / Holger Dau）的协作研究中心1078框架下的财政支持（YZ）。

参考

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