材料和试剂

安全锁反应瓶，1.5毫升（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
微量比色皿，聚苯乙烯（SARSTEDT，目录号：67.742）
37％[wt / vol]甲醛（Merck，目录号：104003）
双去离子水（ddH 2 O; 25℃18.2MΩ）
三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）（Carl Roth，目录号：5429.2）
32％[wt / vol]盐酸（HCl）（Carl Roth，目录号：P074.4）
吐温20（Carl Roth，目录号：9127.2）
硫磺花（AppliChem，目录号：A1687）
注意：本产品已停产;替代产品：默克，目录号：107983。
亚甲基蓝（Merck，目录号：115943）
硫代硫酸钠五水合物（Merck，目录号：106513）
Fuchsine（默克，目录号：105226）
硫酸（Carl Roth，目录号：9316.2）
亚硫酸钠（Merck，目录号：106657）
醋酸锌二水合物（Merck，目录号：108802）
乙酸（Carl Roth，目录号：3738.5）
二甲基-4-苯二胺二盐酸盐（Merck，目录号：103067）
氯化铁（III）六水合物（Carl Roth，目录号：7119.1）
20％[wt / vol]硫化铵溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A1925）
注意：本产品已停产;替代产品：默克，目录号：105442。
SOR测定缓冲液（参见食谱）
亚甲基蓝溶液（见食谱）
硫代硫酸钠溶液（1 mM）（见食谱）
富士山解决方案（见食谱）
亚硫酸钠溶液（1 mM）（见食谱）
醋酸锌溶液（见配方）
二甲基-4-苯二胺二盐酸盐溶液（见配方）
氯化铁（III）溶液（参见食谱）
硫化铵溶液（1 mM）（见配方）

设备

聚丙烯格里芬烧杯250毫升（Carl Roth，目录号：2875.1）
移液器L20，L200，L1000（Abimed LABMATE Optima）
注意：本产品已停产;替代产品：Gilson，目录号：F167350。
磁力搅拌器（例如，，IKAMAG RET; IKA）
Thermomixer基础（震动热块; CellMedia，Elsteraue，德国）
使用SenTix 41 pH电极（Xylem，WTW，目录号：103635）的pH计（Xylem，WTW，型号：inoLab pH720）
注意：产品“Xylem，WTW，型号：inoLab pH值为720”已停产。
离心机Heraeus Pico 17微量离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heraeus ^{TM Pico ^{TM，目录号：75002410） />}}}
分光光度计（例如，Beckmann Coulter，型号：DU-640）
超声波装置（Emerson Electric，Branson，型号：Sonifier 250，目录号：100-132-868）配备了一个宏尖端

软件

Microsoft Excel 365（Microsoft）

程序

SOR测定缓冲液的制备
1. 在塑料烧杯中制备ddH 2 O中的70mM Tris溶液，并用32％[wt / vol]盐酸调节pH值至7.2。
  注意：实际的pH值取决于相应SOR的pH最佳值。
2. 添加2％[wt / vol]元素硫（硫花）和0.1％[vol / vol]吐温20以更好地分散硫。在磁力搅拌器上搅拌约1分钟
3. 将烧杯转移到冰浴中，通过超声处理5分钟，将元素硫分散在10级和100％占空比的宏观提示。
  注意：在洗涤剂存在下对几乎不溶的硫磺花的超声处理将导致细分散的黄色硫悬浮液。
SOR活性测定
1. 将超声处理酶缓冲液搅拌在磁力搅拌器上，并继续搅拌6×1ml至1.5ml反应管。
2. 将反应管用酶缓冲液预热至温热分离器中适当温度5分钟，连续以800rpm振荡。
  注意：培养温度通常取决于相应SOR的最佳值，并且大部分在65℃和85℃之间的范围内。
3. 向第一个反应管中加入2μg酶，每隔30秒对每个连续管重复此步骤（图1）。
  注意：
  1. 首先将酶加入到反应缓冲液中对应于150秒的时间点，最后一次加入对应于酶测定的0秒值。
  2. 根据各个SOR制剂的比活性，测定温度或pH值，酶的量可以提高至100μg/ ml或降低至0.5μg/ ml，以提供合适量的产品用于比色测定（见下文）。
4. 将酶加到最后一个反应管后立即将所有的反应管转移到冰/水浴中以淬灭反应。在冰上保持管约2-3分钟。
5. 将反应管转移到微量离心机并沉淀元素硫（13,000 x g，1分钟）。
6. 使用上清液进行三种比色测定（图1和图2）来量化反应产物。
7. 作为阴性对照，通过向反应小瓶中加入水代替酶溶液，与酶反应缓冲液进行相同的温育，并相应地进行比色测定。
  
  图1. SOR活性测定和比色反应的示意图
  
  图2.比色测定的代表性校准曲线。硫酸铵校准，硫酸盐校准和硫化物校准线性拟合（E）的硫酸铵校准，多项式（C）和线性（D）拟合的多项式（A）和线性（B）拟合。来自3个重复的错误栏。
硫代硫酸盐测定
硫代硫酸盐的定量是基于亚甲蓝的变色（Pachmayr，1960）。
1. 为每个要分析的时间点标记一个微量比色皿。
2. 将250μl酶反应混合物转移到空的比色皿中
3. 加入750μl亚甲基蓝溶液（参见食谱）。
4. 在室温下孵育30分钟
5. 通过分光光度法测定在670nm处的ddH 2 O作为参考。
6. 制备基于1mM新鲜制备的硫代硫酸钠溶液的标准曲线（参见食谱，参见图2A和2B）。进行如上所述的比色测定，并用不同体积的硫代硫酸钠溶液（0,1,5,10,20,50,75和100μl）代替反应混合物;这些值对应于相同量的硫代硫酸盐（nmol）），。用ddH 2 O补足体积至250μl。
  注意：注意，随着硫代硫酸盐（或浓度）的增加，吸光度降低。
亚硫酸盐测定
亚硫酸盐的定量是基于紫苏碱与亚硫酸盐的反应。加入甲醛导致形成稳定的紫色化合物（Pachmayr，1960）。
1. 为每个时间点标记一个1.5 ml反应管。
2. 将50μl紫红色溶液（参见食谱）转移到每个反应管中并加入200μlddH 2 O。
3. 加入250μl酶反应混合物，室温孵育5 min
4. 将5μl37％[wt / vol]甲醛吸入反应管的内盖。
5. 仔细关闭反应管，并短暂地旋下甲醛。
6. 使用L1000移液管将整个混合物转移到比色皿，并在室温下孵育60分钟。
7. 通过分光光度法测定在570nm处的ddH 2 O作为参考。
8. 根据新制备的1mM亚硫酸钠溶液制备标准曲线（参见食谱，参见图2C和2D）。进行如上所述的比色测定，并用不同体积的亚硫酸钠溶液替代反应混合物，如上所述的硫代硫酸盐校准曲线（0,1,5,10,20,50,75和100μl）。 >
硫化氢测定
硫化物的定量是基于亚甲蓝的形成（King and Morris，1967）。
1. 为每个时间点标记一个微量比色杯。
2. 将250μl醋酸锌溶液（参见食谱）转移到每个比色杯中，以固定挥发性硫化氢。
3. 按照提供的顺序加入350μl反应混合物，125μl二甲基-4-苯二胺二盐酸盐溶液（参见食谱）和50μl氯化铁（III）盐酸盐溶液（参见食谱）。
4. 在室温下孵育至少12小时。
  注意：如果需要，孵育时间可以延长至72小时，例如在周末。
5. 通过分光光度法测定在670nm处的ddH 2 O作为参考。
6. 根据新制备的1mM硫化铵溶液制备标准曲线（参见食谱，参见图2E）。如上所述进行比色测定，并用不同体积的硫化铵溶液替代反应混合物，如上述硫代硫酸盐校准曲线（0,1,2.5,5,7.5,10,15和20μl）。 >

数据分析

数据分析使用Microsoft Excel执行。比色测定的光密度的线性增加/减少的范围确定特异性酶活性（图3）。计算各个产品的相应数量并绘制时间。梯度对应于每分钟的产物形成和每个反应混合物中加入的酶的量（=酶活性）。具体的SOR活性定义为每分钟形成1μmol亚硫酸盐加硫代硫酸盐（加氧酶活性）或1μmol硫化氢（还原酶活性），mg蛋白质（= 16.7μkat/ g）。

图3.酸性双歧杆菌的代表性数据SOR酶反应在不同时间点形成硫代硫酸盐（A），亚硫酸盐（B）和硫化物（C） 85℃和pH 7.2，并用1μgSOR测定缓冲液中的2μg纯化酶;误差棒来自一式三份的测量。请注意y轴缩放比例的差异。

笔记

如果在校准曲线的线性范围内着色或变色太强，则比色测定中反应混合物的体积可以缩小到50μl。
在酶测定期间，酶的量可以增加至100μg/ ml，以增强低温测量和/或高/低pH值的比色测定法（例如）的产物形成和敏感性。
在碱性pH下在测定的预热步骤期间，硫花可以含有少量硫代硫酸盐和/或非酶促形成硫代硫酸盐。比色测定中的背景浓度在pH7.2时为8-16nmol / ml，pH9为28-40nmol / ml。
硫化铵和亚硫酸钠溶液应始终用新鲜开水（微波）制备，以除去化学氧化硫化合物的溶解氧。

食谱

注意：

除非另有说明，否则对所有解决方案使用ddH _{2 O。}
硫代硫酸钠溶液，特别是亚硫酸钠和硫化铵溶液不适合长期储存，应当新鲜制备。
如果校准曲线完成，所有其他解决方案可以在室温下储存长达一个月甚至更长时间。虽然解决方案不是特别光敏，但应避免阳光直射。

SOR测定缓冲液（250ml）
70mM Tris（2.1g）用32％HCl调节pH值
0.1％[vol / vol]吐温20（250μl）
2％[wt / vol]元素硫（硫花; 5g）
亚甲蓝溶液（1升）
12mg亚甲蓝溶于5N HCl中
硫代硫酸钠溶液（1 mM）
将0.248g硫代硫酸钠五水合物溶解在10ml ddH 2 O中，用于100mM溶液
制备1：100稀释液，得到最终的1mM硫代硫酸盐溶液（0.1ml 100mM含9.9ml ddH 2 O的硫代硫酸钠溶液）
紫红色溶液（100毫升）
溶于87.5毫升ddH 2 O和12.5毫升浓硫酸的40毫克fuchsine
亚硫酸钠溶液（1 mM）
将0.126g亚硫酸钠溶解在10ml新鲜沸腾（微波）ddH 2 O中，用于100mM溶液
用新鲜沸腾的ddH 2 O制备1：100稀释液，得到最终的1mM亚硫酸盐溶液（0.1ml 100mM亚硫酸钠溶液，9.9ml ddH 2 O） br />
醋酸锌溶液（250毫升）
将6.5g溶于249.75ml ddH 2 O的乙酸锌和250μl100％[wt / vol]乙酸的乙酸溶液
二甲基-4-苯二胺二盐酸盐溶液（100ml）溶解在5M HCl中的0.1g二甲基-4-苯二胺二盐酸盐
氯化铁（III）溶液（50ml）溶解在0.6M HCl中的0.16g铁 - （III）盐酸盐
硫化铵溶液（1 mM）
加入3.4μl20％[wt / vol]硫化铵溶液至10ml新鲜沸腾的ddH 2 O -

致谢

帕特里克·鲁尔得到了德国达姆施塔特的卡洛和卡林·吉尔施特施塔特（Tlo Darmstadt）的奖学金和德意志民主共和国（Arnulf Kletzin）的赞助（Az Kl885-7 / 1）的支持。这个协议是从Kletzin（1989）改编的。 Emmel等人开发了用于硫形成亚硫酸盐的原始酶测定法。（1986）。

参考

Emmel，T.，Sand，W.，König，WA和Bock，E。（1986）。在Sulfolobus brierleyi中存在硫氧化酶的证据。 J Gen Microbiol 132：3415-3420。

King，TE and Morris，R。（1967）。＆nbsp; 酸不稳定硫化物和巯基的测定。 Meth Enzymol 10：634-641。

Kletzin，A。（1989）。＆nbsp; 将酶促生产亚硫酸盐，硫代硫酸盐和来自硫的硫化氢：纯化和来自兼性厌氧古细菌的硫磺氧化还原酶的性质。脱氧沙门菌二恶英。：1638-1643。

Pachmayr，F.（1960）。＆nbsp; Mineralwasser的Vorkommen und Bestimmung von Schwefelverbindungen 慕尼黑的Justus-Maximilian大学的论文。

Pelletier，N.，Leroy，G.，Guiral，M.，Giudici-Orticoni，MT和Aubert，C。（2008）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi .nlm.nih.gov / pubmed / 18060346“target =”_ blank“>来自细菌Aquifex aeolicus的硫加氧酶还原酶的活性寡聚体形式的首次表征极端亲本< / em> 12（2）：205-215。

Rethmeier，J.，Rabenstein，A.，Langer，M.，and Fischer，U.（1997）。＆nbsp; 通过不同的高效液相色谱方法的组合检测小样品中氧化和还原的硫化合物的痕量。 Chromatogr A 760 （2）：295-302。

Rühl，P.，Pöll，U.，Braun，J.，Klingl，A.and Kletzin，A.（2017）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/27920296“target =”_ blank“>来自具有非常低的还原酶活性的卤代碱性细菌硫代胆碱菌悖论的硫氧化酶。细菌> 199（4）。

Sun，CW，Chen，ZW，He，ZG，Zhou，PJ and Liu，SJ（2003）。＆nbsp; 来自酸性嗜热古细菌，Acidianus菌株S5的硫加氧酶/还原酶的纯化和性质极端亲本 7 2）：131-134。

Urich，T.，Bandeiras，TM，Leal，SS，Rachel，R.，Albrecht，T.，Zimmermann，P.，Scholz，C.，Teixeira，M.，Gomes，CM和Kletzin，A。（2004）。＆nbsp; Acidiaus ambivalens中的硫加氧酶还原酶em>是含有低电位单核非血红蛋白中心的多聚体蛋白质。生物化学J 381（Pt 1）：137-146。

Veith，A.，Botelho，HM，Kindinger，F.，Gomes，CM和Kletzin，A.（2012）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi.nlm。 nih.gov/pubmed/22139503“target =”_ blank“>来自嗜温细菌的硫氧还原酶是一种高活性的热酶。 194（3）：677-685。