材料和试剂

100 x 15毫米方格带网格的培养皿（Simport，目录号：D210-16）
任何品牌的无菌移液器提示，适合移液器在3以上
石蜡膜（Bemis，目录号：PM996）
铝箔（任何品牌）
100 x 15 mm圆形培养皿（Fisher Scientific，目录号：S33580A）
滤纸
哥伦比亚-000种子，拟南芥突变种子（ABRC，目录号：CS16284）
家用漂白剂（Clorox或含有5.25％次氯酸钠的任何品牌，室温下储存6个月保质期）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
MS基础盐混合物（Sigma-Aldrich，目录号：M5524），在4℃下储存
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）
植物琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：S5-500）
氢氧化钾（KOH）（Fisher Scientific，目录号：P250-500）
种子灭菌方案（见食谱）
半强度MS琼脂培养基（见食谱）

设备

任何品牌的移液器分配2至20μl，20至100μl和0.1至1.0ml（例如，Eppendorf，目录号：4924000037,4924000061,33123000063或相当的）
生长室（Percival Scientific，型号：AR41L2）
烤箱孵化器（Precision，型号：Thelco孵化器3DM，目录号：51221120）
锋利笔
尺寸放大镜（CWJ，Peak，型号：1983 10x Scale Loupe）
解析范围（Leica Microsystems，型号：Leica MZ6或可比较）
调平台（SP Scienceware - Bel-Art产品 - H-B仪器，目录号：H18310-0000）
1升玻璃瓶（Fisher Scientific）
高压灭菌器

软件

Microsoft Excel
ImageJ（可选）

程序

用于测试适应高温的下胚轴延伸测定
这里描述的测定可以提供关于幼苗对通常致命/严重破坏性高温胁迫耐受的能力的定量数据。
1. 用无菌种子准备板
  1. 通过在溶液中浸泡10分钟，将含有0.1％Triton X-100（种子灭菌溶液[参见食谱]）的50％漂白溶液表面灭菌拟南芥种子。推荐使用比较新鲜的种子（收获不到一年），因为发芽率的变异性较小
  2. 用无菌水冲洗种子五次，以在无菌环境中除去任何残留的漂白剂
  3. 在无菌环境中，将种子放在具有网格的正方形板上的半强度MS琼脂培养基（参见食谱）上，使用无菌移液器吸头，在尖端适当地切割（几毫米）以允许种子通过，理想的是一个一个我们通常在每条线上放置12-13个种子，种子间距甚至均匀（图1）。将种子放置从一条交错到另一条，以避免下胚轴伸长时接触。在每个板上放置适当的对照样品（野生型和热敏感突变体）很重要。
  4. 用Parafilm包裹板，并将板放在4℃2-3天，这有助于同步发芽。
    
    图1.具有均匀放置在每条线上的种子的平板图
2. 幼苗生长和热处理
  1. 热应激前的生长
    用铝箔仔细包裹板，使幼苗保持在黑暗中;下胚轴在黑暗中延伸更多。标记箔片以指示板材的底部边缘相对于幼苗的预期向上生长。让种子通过在22℃下在生长室中以垂直取向支撑板约2.5天，沿着培养基表面发芽并生长。板也可以在适当的温度下保存在任何黑暗的地方。准备进行热应激治疗时，下胚轴的长度约为6〜9毫米（野生型哥伦比亚登陆号）。
  2. 热适应治疗
    将板从铝箔上打开，并将它们放置在38℃的黑暗中的烘箱培养箱中，以适应1.5小时。水平放置平板，以便从架子到介质均匀传热（图2）。需要在22℃（或任何正常的生长温度）作为对照保持另一组重复的板。尽量减少孵化器开放的时间，以减少幼苗的温度波动和暴露。在此期间诱导了许多热休克蛋白（Lin et al。，1984; Hong and Vierling，2000）。
    
    图2.将平板水平放置在烤箱培养箱中
  3. 适应恢复期
    将板从培养箱中取出，并在黑暗的地方保持在22°C两个小时，再次将它们放置在直立位置。在此期间，植物从轻度热处理中恢复，并继续合成热休克蛋白
  4. 严重急性热应激
    将板放在45°C的孵化器中水平放置一段所需的时间。两个小时足以完全抑制在AT1G74310植物中具有T-DNA插入的热缺陷拟南芥线（HSP101淘汰拟南芥线）的生长，同时允许野生型植物（Hong and Vierling，2001）。根据所测试的植物的热敏感性，45℃下的热应力的长度可以变化，例如1.5小时，2.0小时，2.5小时，3.0小时。您还应该拥有接受适应治疗的控制复制板，但在45°C时尚未处理过。确保您在取出板材时快速打开和关闭培养箱，以尽量减少其余植物的温度下降。
  5. 严重热应激后恢复
    热应激处理后，用锋利的笔在板上标记每个下胚轴的尖端位置，再用箔盖住板，确保注意幼苗的生长方向。将板再次放置在垂直位置，让植物在22℃恢复并生长约2.5天。当标记完成时，尽可能减少曝光，如在其余的过程中。如果幼苗长时间暴露在光照下，最终会出现子叶扩张而不是下胚轴伸长。
  6. 下胚轴长度测量
    恢复期后，取出箔片，再次标记下胚轴的尖端。此时，板可以放置在4℃直到测量。野生型哥伦比亚的典型结果如图3所示。下胚轴伸长的长度可以通过使用鳞片放大镜的眼睛来测量。或者，拍摄板并使用ImageJ的测量工具进行测量（Schneider等人，2012）。
    
    图3.野生型的热应激表型A。 th a）。。。。。。。。 indicated，，，，，，，，，and and and and and and and and from from from from from，，，。。。 AC：驯化处理：38℃/ 1.5小时，随后22℃/ 2小时。
轻度生长的7-10日龄幼苗的热胁迫测定
1. 用种子琼脂培养基对圆形培养皿进行表面消毒并将其放置在A1部分中。将板块分成相等的部分。如果将100 x 15毫米的培养皿分成六个部门，每个部门放置18-20粒种子。将相同的基因型放在板对面的扇区中是一个很好的做法。
2. 用Parafilm包裹板，并在4℃下放置2-3天进行分层。
3. 将板移动到生长室，让幼苗在长的天气条件（22℃/ 18℃，16小时/ 8小时夜间循环）下生长7-10天，光强度为〜80 μmolm -2 sec -1 。如果对特定基因型提供更好的生长，也可以使用短时间。
4. 在如上所述的下胚轴延伸测定的烘箱培养箱中进行热处理，根据需要改变时间长度以便区分基因型。驯化处理与下胚轴延伸测定相同。再次，尝试通过在打开和关闭培养箱时快速作用来最小化温度下降。确保您没有驯化处理的控制板，以及连续保持最佳生长温度的板材进行比较。
5. 热处理后，将板放回生长室，使其恢复5-8天。当表型差异最佳时，您可以拍照。
发芽耐热性
在萌发之前，种子具有显着更高的耐热性，并且已经记录了拟南芥种质之间种子耐热性的变化（Clerkx等人，2004）。
1. 为了进行这种测试，不需要对种子进行灭菌。然而，因为萌发对母体效应以及种子储存条件敏感，所以只能在相同条件下种植和收获种子并储存的种子进行比较。
2. 在用相同体积的水饱和的滤纸上将培养皿中的种子播种到所有板上。体积应足以使滤纸完全润湿而不会留下多余的水分。将待测试的每种基因型的30至50粒种子均匀地分布在滤纸上，使用每种基因型的单独的板。允许种子在室温下吸收18小时。为了保持水分，培养皿应在整个测定过程中用水饱和的滤纸封闭在底部衬里的塑料盒中。
3. 通过将板直接转移到50℃8小时进行热处理，然后将其返回到室温以评定发芽。使用在室温下保持的相同的板作为种子批发芽势的对照
4. 在7天后确定终点处的发芽率，或每天记录发芽率以估计发芽率差异。在解剖范围内评分小种子，例如拟南芥，或者通过拍摄和评分在计算机屏幕上观看的放大图片。将种子评为在激进出现的第一个迹象上发芽。
幼苗绿化耐热性
黑色生长的幼苗积累叶绿素的能力可以在有或没有驯化处理的情况下测试耐热性。下面的测定不适用驯化。
1. 用下胚轴延伸测定法准备具有幼苗的板材，并在黑暗中垂直生长幼苗2.5至3天。
2. 在阴凉处处理43℃，120分钟的幼苗板。留下重复的一组板未经处理。也可以测试43℃的不同长度的时间，以便在需要时提供基因型之间的分辨率
3. 将板在水平或垂直方向放置在室温或室内光照或低光（50至80μEm -2至 sec -1 ）的生长中室在22°C。可以使用任何日期长度或连续光线。记录板级光强度，供日后的实验参考。
4. 每天记录子叶绿化，用眼睛判断为绿色，浅绿色，黄绿色或黄色子叶的幼苗数量。在光明三天后，在终点再次得分。子午线也可以每天进行扩展/打开。
其他热应激治疗
上述的热应激处理已广泛用于拟南芥研究中。然而，确切的时间和温度也可以变化以测定不同的表型。例如，驯化预处理可以通过在3〜4小时内将温度从20℃逐渐升高到22℃至45℃的应力温度来进行（Larkindale和Vierling，2008）。这需要具有温度升高能力的适当的室，这是大多数实验室的限制性资源。然而，这种逐渐适应的处理被证明可以在恢复应力之后提供比上述驯化处理更好的幼苗生存力。另一个可以改变的参数是驯化处理和热应激处理之间的时间，可以评估不同基因型保持适应能力的差异。 Yeh等人。（2012）描述了可在耐热测定中修改的其他参数。
适应其他植物物种的分析
如背景技术部分所述，原始的胚轴伸长测定法适应于大豆实验（Lin等人，1984），其他植物物种可以类似地测定适应高温。为此，只需进行仔细的初步实验来确定幼苗萌发率和下胚轴生长程度或其他参数，以及导致不同种类的不同种类的热杀死或幼苗生长停滞的时间和温度成长阶段

数据分析

下胚轴延长分析
使用Microsoft Excel绘制x轴上的基因型和y轴上相应的下胚轴长度。当有突变体生长缺陷时，相对于每个基因型的对照（无热处理）生长，标准化长度。一个例子如图4所示。适应驯化后45°C / 2 h处理的典型标准偏差约为野生型Columbia的10％，当长度与对照生长正规化时。统计学意义可以通过执行学生的测试来测试。必须进行至少三次独立实验，重复性相似。

图4.显示热处理后各种拟南芥基因型（45℃/ 80分钟，然后热适应，Kim等人修改）的下胚轴延伸的实例图。，2012）。突变体的突变体生长比野生型和更慢，因此下胚轴生长通过生长正常化未经热处理的幼苗的相同时间段。错误栏表示SE; n = 12.
轻度生长的7-10日龄幼苗的热胁迫测定
当表型差异最佳时，拍照，通常在热处理后5〜8天发生。一个例子如图5所示。为了使测定更定量，计算已经存活的幼苗，并绘制生存百分比，如Larkindale等人所述。（2005年）。如程序详述，也是良好做法，在板的对面植入相同基因型的部分，以解释热分布的差异。即使温差较小也可能导致不同的结果。将基因型与同一板进行比较也是至关重要的。必须进行至少三次独立实验，重复性相似。

图5.如图所示，10天龄的幼苗受热应激。照片在治疗后7天（从Kim等人，2012修改）拍摄。
发芽耐热性
将种子发芽的结果作为相同种子批次的未处理种子的百分比表示。如果每天收集数据，结果可以绘制为线图。如果仅在终点收集数据，请使用表格显示数据。
幼苗绿化耐热性
将子叶绿化的结果作为条形图显示，与不进行热处理的幼苗相比，每天显示不同绿化阶段的子叶百分比。类似地，开放子叶的百分比也可以作为未处理幼苗的百分比绘制。统计学意义可以通过执行学生的测试来测试。应进行至少三次独立实验，每基因型和处理20至30个幼苗

笔记

小心不要损坏黑色生长的幼苗的铝箔覆盖层。另外，尽量减少处理过程中幼苗的光照。漏光使植物在子叶开放扩张的同时发生光形态发生，同时防止下胚轴伸长
重要的是不要使培养箱超载，并且要注意孵化器不同部位的温度差异。如果培养箱的校准不准确，还要比较不同的培养箱，最好使用温度计检查培养箱的温度。幼苗对精确的温度非常敏感，差异只有±1°C可以显着改变结果
我们使用烤箱保温箱进行黑热处理。然而，其他研究人员将紧密密封的板放在水浴中，这可能有助于传热并防止温度波动（Charng等人，2006）。
标记幼苗生长是重要的，因为它允许您在热应激之前将热分解后的生长与热应激后的生长分开。这可以使不同基因型之间的下胚轴长度不同而发芽率也有差异。
当用MS琼脂培养基制备板时，在校平台上的每个板中倒入相同量的培养基（例如，10×100mm×15mm方形陪替氏培养皿）。这将降低板之间以及板内的温度变化。
当测量发芽的耐热性时，所有基因型应在三次重复测试中进行统计分析。结果应相对于未加热对照的发芽表达。可以改变热应激的温度或时间，以增加基因型之间差异的分辨率。如果种子在18小时吸收期后发芽，可缩短热处理之前的吸收时间。
对于本文所述的所有测定，通过比较基于未处理的种子或相同基因型的幼苗计算的基因型进行基因型之间的比较。此外，只要有可能，优选使用在同一时间和相同条件下生长的植物中的种子，并在相同条件下储存种子。这对于确定基因型之间耐热性是否存在显着差异很重要，特别是如果差异很小。重复使用多批种子对于确认基因型之间的小差异至关重要。
对于热应激光生长的幼苗或子叶绿化的耐热性的测定，也可以通过从由Burke等人开发的对照和热应激样品的等量的幼苗中提取叶绿素来获得定量结果。（2000）

食谱

种子灭菌溶液（100 ml）
50ml漂白剂
50ml蒸馏水
500μl20％Triton X-100（0.1％终浓度）
注意：解决方案可以在室温下保存在阴暗的地方长达一个月。
半强度MS琼脂培养基（1000毫升）
2.15克MS基础盐混合物（4℃保存）
0.5g 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）水合物 5克蔗糖
加入900毫升蒸馏水，搅拌溶解使用1N KOH调节pH至5.7 加入蒸馏水至最终体积为1000 ml
将介质分成两个1升玻璃瓶。在每个瓶子里加入4g植物琼脂高压灭菌器在121℃，15psi下进行30分钟注意：将溶液进行高压灭菌后，将其冷却至约60℃，并在无菌环境中的校平台上的每个板中倒入固定量的培养基（10-30ml）。琼脂的量影响板内部温度升高的速率，因此重要的是每个板加入完全相同量的介质。倒入板后，让它们在无菌环境中固化并干燥20分钟。未使用的介质板可以在密封的容器中以4°C倒置存放数月。

致谢

美国能源基础生物科学计划，美国农业部国家研究计划竞争性资助计划以及生物科学院国家科学基金会分子生物科学部门向EV提供资助。种子萌发测定是在支持古根海姆研究金与EV的情况下开发的。这些协议由Hong和Vierling，2000和Larkindale等人，2005修改和修改。

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